实训2 细胞色素C粗品的制备及含量测定

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1、实训2　细胞色素C粗品的制备及含量测定【背景介绍】细胞色素（Cytochrome）是一类含铁卟啉辅基的电子传递蛋白，在线粒体内膜上起传递电子的作用。线粒体中的细胞色素大部分与内膜紧密结合，而细胞色素c是电子传递链中唯一的外周蛋白，在线粒体呼吸链位于细胞色素b和细胞色素aa3之间，位于线粒体内侧外膜，结合较松，较容易分离纯化。图2-1细胞色素c分子结构式每个细胞色素c分子含有一个血红素和几条多肽链如图2-1，分子中含赖氨酸较高，所以等电点偏碱，pI为9.8～10.8，相对分子质量为12000～13000D。它易溶于水及酸性溶液，且较稳定，不易变性。细胞色素c分为氧化型和还

2、原型两种，因为还原型较稳定并易于保存，一般都将细胞色素c制成还原型。氧化型细胞色素c在408nm、530nm有最大吸收峰，还原型细胞色素c的最大吸收峰为415nm、520nm和550nm。在pH为7.2～10.2，100℃加热3min，细胞色素c氧化型和还原型的变性程度均为18%～28%，增加加热时间，氧化型的不可逆变性比还原性高。细胞色素c对酸碱较稳定，可抵抗0.3mol/L盐酸和0.1mol/L的氢氧化钾溶液的长时间处理。一般都将细胞色素c制成稳定的还原型。细胞色素c溶液用于各种组织缺氧急救的辅助治疗，如一氧化碳中毒、催眠药中毒、氰化物中毒、新生儿窒息、严重休克期缺

3、氧、脑血管意外、脑震荡后遗症、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难和各种心脏疾患引起的心肌缺氧的治疗。其作用原理为在酶存在的情况下，对组织的氧化、还原有迅速的酶促作用。通常外源性细胞色素c不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素c便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，能提高氧的利用。一般来说，组织的细胞色素c的含量与它们的呼吸活性大致成平行关系，在心肌与其它剧烈运动的肌肉中含量最为丰富，在酵母中含量也比较丰富。猪心价格便宜，提取方便，适宜于进行实验。【参考提取工艺】离心透析三氯乙酸沉淀人造沸石吸附，洗脱酸性提取绞碎猪心提取液调节pH7.2收集洗脱液盐析除杂

4、上清液沉淀细胞色素c粗品溶液1.材料处理取新鲜或冰冻猪心，除去脂肪和结缔组织，用水洗去积血，切成小块，放入绞肉机绞成糜。2.提取称取500g肌肉糜，入入2000mL烧杯中，加蒸馏水1000mL，在电动搅拌器搅拌下以1mol/LH2SO4溶液调pH至4.0（此时溶液呈暗紫色），在室温下搅拌提取2h，在提取过程，使抽提液的pH值保持在4.0左右。在即将提取完毕，停止搅拌之前，以1mol/L的氨水调pH至6.0，停止搅拌。用八层普通纱布压挤过滤，收集滤液。滤渣加入750mL蒸馏水，再按上述条件提取1h，两次提取液合并。3.中和用1mol/L的氨水调上述提取液至pH7.2（此时

5、，等电点接近7.2的一些杂蛋白溶解度小，从溶液中沉淀下来），静置30～40min，过滤，所得滤液准备通过人造沸石柱进行吸附。4.吸附与洗脱（1）人造沸石的预处理：称取人造沸石11g，放入500mL烧杯中，加水搅拌，用倾泻法除去12s内不下沉的过细颗粒。（2）装柱：选择一个底部带有滤膜的干净的玻璃柱（2.5×30cm），柱下端连接一乳胶管，用夹子夹住，柱中加入蒸馏水至2/3体积，保持柱垂直，然后将已处理好的人造沸石带水装填入柱，注意一次装完，避免柱内出现气泡。（3）上样：柱装好后，打开夹子放水（柱内沸石面上应保留一薄层水），将准备好的提取液装入下口瓶，使其通过人造沸石柱进

6、行吸附。柱下端流出液的速度为1.0mL/min。随着细胞色素c的被吸附，柱内人造沸石逐渐由白色变为红色，流出液应为黄色或微红色。（4）洗脱：吸附完毕，将红色人造沸石从柱内取出，放入500mL烧杯中，先用自来水，后且蒸馏水搅拌洗涤至水清，再用100mL0.2%NaCl溶液分三次洗涤沸石，再用蒸馏水洗至水清。按第一次装柱方法将人造沸石重新装入柱内，用25%(NH4)2SO4溶液洗脱，流速约为2mL/min，收集含有细胞色素c的红色洗脱液，当洗脱液红色开始消失时，即洗脱完毕。（5）人造沸石再生：将使用过的沸石，先用自来水洗去(NH4)2SO4，再用0.2mol/LNaOH和1

7、mol/LNaCl混合液洗涤至白色，前后用蒸馏水反复洗到pH7～8即可。5.盐析按每100mL洗脱液加入20g固体硫酸铵，使溶液硫酸铵的饱和度为45%，边加边搅拌，静置12h，过滤或离心除去杂蛋白沉淀，得到红色透亮的细胞色素c溶液。（6）三氯乙酸沉淀在搅拌情况下向所得到的红色透亮的细胞色素c溶液每100mL中加入2.5mL20%三氯乙酸溶液，细胞色素c立即沉淀出来（沉淀出来的细胞色素c属可逆变性），立即于3000r/min离心15min，收集沉淀。加放少许蒸馏水，用玻棒搅拌，使沉淀溶解。7.透析将溶解于少量蒸馏水的细胞色素c溶液装入透析袋