细胞色素C的分离制备和测定

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1、细胞色素C的分离制备和测定【实验目的】1．学习细胞色素C的理化性质及其生物学功能。2．掌握制备细胞色素C的原理。3．掌握制备细胞色素C的操作技术。【实验原理】细胞色素C是呼吸链的一个重要组成成份。是一种含铁卟啉基团的蛋白质，在线粒体呼吸链上位于细胞色素b和细胞色素aa3之间，细胞色素C的作用是在生物氧化过程中传递电子。细胞色素C分子中含赖氨酸较高，所以等电点偏碱，为pH 10.8，分子量为12000～13000道尔顿。它易溶于水及酸性溶液，且较稳定，不易变性，组织破碎后，用酸性水溶液即能从细胞中浸提

2、出来。细胞色素C分为氧化型和还原型两种，因为还原型较稳定并易于保存，一般都将细胞色素C制成还原型的，氧化型细胞色素C在408nm、530nm有最大吸收峰，还原型细胞色素C的最大吸收峰为415nm、520nm和550nm，这一特性可用于细胞色素C的含量测定。    由于细胞色素C在心肌组织和酵母中含量丰富，常以此为材料进行分离制备。本实验以猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱，三氯醋酸沉淀等步骤制备细胞色素C，并测定其含量。【实验材料】1. 实验器材绞肉机；电磁搅拌器；电动搅拌器；

3、离心机；72l型分光光度计；玻璃柱(2.5×30cm)；下口瓶； 烧杯(2000、1000、500m1)；量筒；移液管；玻璃漏斗和纱布；玻璃棒；透析袋2. 实验试剂⑴ 2M H2SO4溶液；1M NH4OH溶液；固体硫酸铵⑵ 25％硫酸铵溶液: 100m1蒸馏水中含25克硫酸铵，约相当于25℃时40％的饱和度⑶ 0.2％氯化钠溶液：称0.2克氯化钠，用蒸馏水溶解并定容至100ml.⑷ BaCl2 试剂： 称12克BaCl2 , 溶于100ml蒸馏水中。⑸ 20％三氯醋酸溶液(6) 人造沸石(60～8

4、0目)⑺ 联二亚硫酸钠(Na2S2O4·2H2O)【实验操作】1．细胞色素C的制备⑴ 材料处理:取新鲜或冰冻猪心，除去脂肪和韧带，用水洗去积血，将猪心切成小块，放入绞肉机绞碎。⑵ 提取:称取绞碎猪心肌肉500克，放人2000m1烧杯中，加蒸馏水1000ml，在电动搅拌器搅拌下以2M H2S04调pH至4.0(此时溶液呈暗紫色)，在室温下搅拌提取2小时，在提取过程，使抽提液的pH值保持在4.0左右。在即将提取完毕，停止搅拌之前，以1M NH40H调pH至6.0，停止搅拌。用八层普通纱布压挤过滤，收集滤

5、液。滤渣加入750m1蒸馏水，再按上述条件提取1小时，两次提取液合并。⑶ 中和:用1M NH4OH调上述提取液至pH 7.2(此时，等电点接近7.2的一些杂蛋白溶解度小，从溶液中沉淀下来)，静置30～40分钟中后过滤，所得滤液准备通过人造沸石柱进行吸附。⑷ 吸附与洗脱:人造沸石容易吸附细胞色素C，吸附后能被25％的硫酸铵洗脱下来，利用此特性将细胞色素C与其它杂蛋白分开。具体操作如下：①人造沸石的预处理：称取人造沸石11g，放入500m1烧杯中，加水搅拌，用倾泻法除去12秒钟内不下沉的过细颗粒。② 装

6、柱：选择一个底部带有滤膜的干净的玻璃柱(2.5×30cm)，柱下端连接一乳胶管，用夹子夹住，柱中加入蒸馏水至2/3体积，保持柱垂直，然后将己处理好的人造沸石带水装填人柱，注意一次装完，避免柱内出现气泡。③ 上样：柱装好后，打开夹子放水(柱内沸石面上应保留一薄层水)将准备好的提取液装入下口瓶，使其通过人造沸石柱进行吸附。柱下端流出液的速度为1.0ml/分钟。随着细胞色素C的被吸附，柱内人造沸石逐渐由白色变为红色，流出液应为黄色或微红色。④ 洗脱：吸附完毕，将红色人造沸石从柱内取出，放入500m1烧杯中

7、，先用自来水，后用蒸馏水搅拌洗涤至水清，再用100m1 0.2％NaCl溶液分三次洗涤沸石，再用蒸馏水洗至水清，按第一次装柱方法将人造沸石重新装入柱内，用25％硫酸铵溶液洗脱，流速大约2ml/分钟，收集含有细胞色素C的红色洗脱液，当洗脱液红色开始消失时，即洗脱完毕。人造沸石可再生使用。⑤ 人造沸石再生：将使用过的沸石，先用自来水洗去硫酸铵，再用0.25M氢氧化钠和lM氯化钠混合液洗涤至沸石成白色，前后用蒸馏水反复洗至pH7～8，即可重新使用。⑸盐析：为了进一步提纯细胞色素C，在上面收集的洗脱液中，加

8、入固体硫酸铵(按每l00m1洗脱液加入20克固体硫酸铵的比例，使溶液硫酸铵的饱和度为45％)边加边搅拌，放置30分针后，杂蛋白便从溶液中沉淀析出，而细胞色素C仍留在溶液中，用滤纸(或离心)除去杂蛋白，即得红色透亮细胞色素C溶液。(6) 三氯醋酸沉淀：  　在搅拌情况向所得透亮溶液加入20％三氯醋酸(2.5m1三氯醋酸/100m1细胞色素C溶液)，细胞色素C立即沉淀出来（沉淀出来的细胞色素C属可逆变性)，立即于3000转/分钟离心15分钟，收集沉淀。加入少许蒸馏水，用玻