细胞色素C的分离纯化课件.ppt

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1、细胞色素C的分离纯化人造沸石为铝酸钠，它是一种阳离子交换剂，细胞色素C分子刚好进入它的表面空隙。在pH7.5（pH＜pI）时，细胞色素C呈正电荷，它可与沸石分子上的钠离子发生交换，从而被沸石吸附。一.人造沸石吸附细胞色素CNH3+NH3+Z－Z－Na+＋pP＋Na＋COOHCOOH用25％硫酸铵洗脱，又可将细胞色素C交换下来。硫酸铵的主要作用是降低沸石对细胞色素C的亲和力。NH3+Z－NH3＋P＋（NH4）2SO4P＋Z－NH4＋COOHCOOH人造沸石在酸性条件下分解,在碱性条件下变粘,所以在中性条件下使用.二.蛋白质的盐析作用维持蛋白质亲水胶体特性的

2、两个重要因素是蛋白质分子表面的电荷和水化膜，其中任何一个因素受到破坏，都会降低胶体的稳定性，使蛋白质分子聚集而发生沉淀。利用盐析沉淀蛋白质的基本原理：盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。蛋白质沉淀图盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”（Saltingin）。而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析出，这种现象称为“盐析”（Saltingout）。这

3、些现象的原理大致是由于蛋白质是亲水胶体，带有羧基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证蛋白质形成溶于水的溶胶状态。当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上的极性基团，因而增大了蛋白质在水中的溶解度，出现“盐溶”现象。一但当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来；另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子表面的极性基团所带的电荷，减少了蛋白质分子间的相互排斥力，蛋白质分子相互碰撞时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐析

4、”现象。由于各种蛋白质分子所带的电荷数目不同，它们在蛋白质表面上分布情况也不一样，因此将不同蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度也各异，盐析所需的最小盐量称做盐析浓度。盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步“盐析”出来，达到分离目的蛋白质。盐析法是1878年Hammarster首次使用的，他用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白、球蛋白两部分。自那以后曾使用过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐来盐析蛋白质，其中运用最广的是硫酸铵。因为硫酸铵有许多其他盐所不具备的优点，如在水中化学性质稳定；溶解度大；溶解度的温度系数变化较小，在0～30℃

5、范围内溶解度变化不大，如25℃时饱和溶解度为4.1mol／L，即767g／L，0℃时饱和溶解度为3.9mol／L，即676g／L。而且硫酸铵价廉易得，分段效果比其他盐好，性质温和，即使浓度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。因此，现在所指的盐析法实际上多为硫酸铵盐析法。用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般以饱和度来表示。实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1。盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或1饱和度的百分之几，即称为该蛋白盐析的饱和度。饱和度可以根据情况用下述两种方法计算。⒈饱和硫酸铵溶液法(荷

6、氏（Hofoneister）饱和度:其定义为在盐析溶液中所含的饱和硫酸铵体积与总体积之比。)在蛋白质溶液的总体积不大，要求达到的饱和度在50%以下时，可选用此方法。在已知盐析出某种蛋白质成分所要达到的饱和度时，可按下列公式计算出应加入饱和硫酸铵溶液的数量：式中V0——蛋白质溶液的原始体积；C2——所要达到的硫酸铵饱和度；C1——原来溶液的硫酸铵饱和度；V——应加入饱和硫酸铵溶液的体积。将计算所得体积的饱和硫酸铵溶液加入到混合蛋自质溶液中，即可达到盐析的目的。严格讲，混合两种不同溶液时，混合后的总体积并不等于混合前两种溶液体积之和，而上式中是按相等于计算的

7、，所以会产生误差。但实验证明所造成的误差一般小于2%，故可忽略不计。2．固体硫酸铵法(欧氏（Osborne）饱和度:定义为溶液中所含的硫酸铵重量与该溶液所能饱和溶解的硫酸铵重量之比。)所需达到的饱和度较高，而蛋白质溶液的体积又不能再过分增大时，采用直接加入固体硫酸铵的方法。欲达到某种饱和度可按下列公式计算出应加入固体硫酸铵的数量：X是将lL饱和度为C1的溶液提高到饱和度为C2时，需要加入固体硫酸铵的重量（g）。C和A为常数，数值与温度有关。现在已将达到各种饱和度所需固体硫酸铵的数量列成表，使用时不需计算可直接从下表中查出。实验中得到25%(大约饱和度40

8、%)硫酸铵的洗脱液,然后需要加入固体硫酸铵到45%(大约饱和度67%,相对密度1