中国林蛙皮肤丝氨酸蛋白酶抑制剂RCSPI2的基因克隆和原核表达

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1、万方数据第34卷第3期20l0年5月水生生物学报ACTAHYDROBl0LOGICASINICAV01．34。NO．3May，2010DOI：10．3724／SP．J．1035．2010．00629中国林蛙皮肤丝氨酸蛋白酶抑制剂RCSPl2的基因克隆和原核表达张曙光张哲文张丽芳王孝敏尚德静(辽宁师范大学生命科学学院，辽宁省生物技术-ff分子药物研发重点实验室，大连116029)CLoNlNGANDPROKARYOTICEXPRESSIONOFTHESERINEPRoTEASEINHIBIToRRCSPl2FROMTHESKlNoFCHIN

2、ESEBROWNFRoGS．RANACHEMSfⅣENS!，JSZHANGShu·Guang，ZHANGZhe-Wen，ZHANGLi—Fang，WANGXiao—Min，SHANGDe·Jing∞iaoningProvincialKeyLaboratoryofBiotechnologyandDrugDiscovery，CollegeofLifeScience，LiaoningNormalUnivers砂，Dalian116029，China)关键词：中国林蛙：丝氨酸蛋白酶抑制剂；基因克隆；原核表达Keywords：Ranachensin

3、ensis；RCSPl2；Serineproteaseinhibitor；Genecloning；Prokaryoticexpression中图分类号：Q781文献标识码：A文章编号：1000-3207(2010)03—0629—05丝氨酸蛋白酶抑制剂广泛存在于动物、植物及微生物体内【1】，是一类丝氨酸蛋白酶活性调节剂，能调节生物体内许多重要的生命过程，如蛋白质折叠、血凝、补体激活、炎症反应、细胞迁移、细胞基质重建、以及肿瘤抑制等【2，一1，很多已被开发为新药，在临床上有广泛应用。基于其序列、拓扑结构及功能的相似性，能分成16个家族f4】

4、，是一个蛋白超家族，每个家族成员都具有相似的氨基酸顺序、保守的三级结构和独特的作用机制【5】。两栖类动物是由从不同水生鱼类演化到陆生爬行动物的过渡类群【61，其皮肤对维持自身生存和适应栖息地多样化环境以及防御微生物入侵起着重要作用。过去人们一直把研究聚集在两柄类皮肤的生物活性多肽上，大量结构多样，功能迥异的生物活性多肽被获得，分为抗菌肽和调节肽【71。最近，在两栖类动物的皮肤分泌物中，也分离鉴定出丝氨酸蛋臼酶抑制剂，如来自欧洲铃蟾(Bombingbombina)的BSTll引。由60个氨基酸组成，包括10个半胱氨酸残基，其分子结构模型和从

5、线虫及猪蛔虫中得到的蛋白酶抑制剂相同，是胰蛋白酶和凝血酶抑制剂，为值从0．1到lpmol／L。大蹼铃蟾白蛋白BMTI来自于大蹼铃蟾(Bombingmaxima)[9。，由60个氨基酸组成，是胰蛋白酶抑制剂，与BSTI的同源性达81．7％，具有独特的空间结构及抑制机制，是一类新的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员。来源于番茄蛙(Dyscophusguineti)皮肤的丝氨酸蛋白酶抑制剂属于Kunitz型，由57个氨基酸组成，与典型的Kunitz型蛋自酶抑制剂BPTI同源性为38％，含两个与胰蛋白酶作用的活性位点，猜测在番茄蛙皮肤内合成的丝氨酸蛋白酶

6、抑制剂有可能是其抵御微牛物侵袭的一种防御措施【m1。到目前为止，在两柄类中发现分子量最小的丝氨酸蛋白酶抑制剂是来源于无指盘臭蛙皮肤中的TILtll】，氨基酸序列为CWTKSIPPKPC，N端半胱氨酸和C端半胱氨酸形成二硫键，所以整个分子呈环形，基于TIL设计的多肽，同时具有抗菌活性与胰蛋白酶抑制剂活性。中国林蛙(Ranachensinensis)是我国东北地区资源优势的经济蛙种，其皮肤在复杂多变的生态环境中起着调节水平衡、抵抗猎食者、抗菌、外分泌等多方面的功能【l21。目前。国内对中国林蛙皮肤生物活性成分缺少系统的研究1131。本实验首次

7、成功的从中国林蛙皮肤中克隆出具有胰蛋白酶抑制活性的丝氨酸蛋白酶抑制剂RCSPl2全长cDNA序列，并将其编码区连接到表达载体pET32a上进行原核表达，经过多种诱导条件的筛选，获得了RCSPl2的稳定表达。经Ni2+-N1’A柱纯化及分步透析复性，得到收稿日期：2009．07．3l；修订日期：2010-01．24基金项目：辽宁省优秀人才项目(2007R27)资助作者简介：张曙光(1984一)，女。汉族，辽宁葫芦岛人；在读硕士；主要从事分子生物学研究。E-mail：shuguang_0329@sohu．com通讯作者：尚德静，E．tnail

8、：djshang@Innu．edu．cn万方数据630水生物学报34卷了高纯度的具有生物活性的重组蛋白RCSPl2。采用BAPNA方法对重组蛋白RCSPl2的生物活性进行了研究，期望本实验为两