昆明山海棠碱诱导JurkatT淋巴瘤细胞凋亡的分子机理研究

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1、兰州医学院硕士学位论文昆明山海棠碱诱导JurkatT淋巴瘤细胞凋亡的分子机理研究姓名：赵钦军申请学位级别：硕士专业：劳动卫生与环境卫生学指导教师：肖卫;曹佳2003.5.1兰州医学院硕士学位论文昆明山海棠碱诱导JurkatT淋巴瘤细胞凋亡分子机理的研究摘要细胞凋亡(apoptosis)，或称为细胞程序性死亡(programmedcelldeath，POD)，是细胞在内外因子的调控下，按一定的程序“自杀”。细胞凋亡在许多疾病的发生发展过程中有着重要作用，凋亡失调是多种疾病的一个共同特征，这些疾病包括自身免疫性疾病、神经退化性疾病、癌症和AI

2、DS，因此凋亡机理研究越来越受到人们的重视。昆明山海棠(TripterygiumHypoglaucum(Levl．／JHutch，简称THH)是传统中药，属卫矛科雷公藤属植物，分布在我国西南地区，临床上主要用于治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮等自身免疫病以及其它疾病，其毒性远小于雷公藤。近年来，本课题组的研究首次发现THH能诱导多种细胞凋亡。THH的主要成分有生物碱、色素剂类和萜类，其中生物碱在I临床上疗效最好且毒副作用最小，因此亟待研究THH生物碱诱导凋亡的效应和机理。哺乳动物细胞凋亡主要有两条生物学途径：死亡受体(Fas配体或TNFQ介导

3、)途径和线粒体途径，之后激活下游的caspase级联反应，导致DNA片段化，形成凋亡小体，细胞走向死亡。为此，本文以JurkatT淋巴瘤细胞为主要研究材料，对昆明山海棠碱诱导细胞凋亡通路中的多种生物化学标志蛋白和形态学变化进行检测，主要研究内容和结果如下：1．THH碱的制取：制取后无菌安瓿分装，全部实验均采用同批样品，所有样品重复性好，效果稳定。2．Jurkat细胞的生长和活力的测定：THH碱可抑制Jurkat细胞的生长，细胞生长活力下降。3．磷酯酰丝氨酸外翻检测：凋亡发生后的一个典型变化是磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserin

4、e，PS)会自细胞膜的内面转到外面。实验表明THH碱诱导Jurkat细胞后，PS外翻显著增加。4．荧光显微镜观察显微结构：用Annexin—VFITC和PI双标后，荧光显微镜观察可见细胞由圆形变成椭圆形或不规则形，膜边缘有多个突起，核质浓缩成一个或几个大的团块，核进而裂解为碎兰州医学院硕士学位论文块并在细胞内出现由胞膜包裹的凋亡小体。5．流式细胞仪检测细胞凋亡：用Annexin—VFITC和PI双标后，流式细胞仪检测显示，THH碱诱导Jurkat细胞后，凋亡细胞明显增加，并呈时间和剂量依赖性。6．Bcl-2蛋白表达分析：Bcl一2蛋白在正

5、常Jurkat细胞阳性表达，THH碱诱导后显示Bcl一2蛋白表达明显降低，同时亦表明Bcl—2蛋白的变化应是晚期事件。7．FasL蛋白表达分析：FasL蛋白在正常Jurkat细胞阳性表达，试验表明That碱诱导后FasL蛋白的表达量快速上升，且持续长时间的高表达。8．caspase一8凋亡蛋白酶的剪切激活检测：在正常Jurkat细咆该凋亡蛋白酶以procaspase一8的酶原形式存在，THH碱诱导后显示procaspase一8蛋白表达量明显降低，同时活性形式caspase一8蛋白的表达量则明显的上升。9．caspase一7凋亡蛋白酶的剪切

6、激活检测：在正常Jurkat细胞该凋亡蛋白酶以procaspase一7的酶原形式存在，THH碱诱导后procaspase一7和caspase一7蛋白酶的表达量均增加，尤以caspase一7蛋白酶更为显著。兰州医学院硕士学位论文10．Bid蛋白的剪切激活检测：在正常Jurkat细胞以Bid酶原形式存在，THH碱诱导后其剪切激活的活性形式tBid蛋白表达量明显增加，同时Bid蛋白的表达量则明显降低。11．p38MAPK和JNK，蛋白表达分析：p38MAPK和JNK。在正常Jurkat细胞阳性表达，THH碱诱导后未检测到显著变化。本试验的结果提

7、示，THH碱可有效的诱导Jurkat细胞的凋亡且推测主要途径为：THH碱一FasL蛋白的高表达一死亡诱导信号复合体(DISC)形成一caspase一8蛋白自身剪切激活，一方面caspase-8可剪切激活caspase-7蛋白，另一方面caspase-8蛋白剪切激活Bid，同时Bcl一2的表达下调一线粒体改变，释放其凋亡相关的效应因子一激活Caspase一9一Caspase一3活化，活化的Caspase一7、Caspase一3这些蛋白酶的级联切割过程最终导致DNA断裂、片段化、凋亡小体产生、细胞走向凋亡。关键词：昆明山海棠，细胞凋亡，Jur

8、kat细胞，磷酯酰丝氨酸，凋亡蛋白酶，Bcl一2，FasL，Bid，p38MAPK，JNK一兰塑墨兰堕婴主兰堡丝苎STUDYoNMoLECULARMECHANISIMOFAPoPTOSISIN