小分子化合物诱导人肺腺癌A549细胞凋亡机理研究

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1、山东大学硕士学位论文小分子化合物诱导人肺腺癌A549细胞凋亡机理研究姓名：潘效红申请学位级别：硕士专业：细胞生物学指导教师：苗俊英20080516山东大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：瘗垂羔兰兰日期：垒竺＆：上：丛关于学位论文使用授权的声明本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和电子版，允许论文被查

2、阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：逸赵l：兰导师签名：趁篓日期：2幺22：f：丛山东大学硕士学位论文中文摘要小分子化合物诱导人肺腺癌A549细胞凋亡机理研究研究目的近年来，肺癌死亡率居于各种恶性肿瘤之首位，其中肺腺癌最常见并且其发病率最高。由于肿瘤发生和生长的主要原因在于细胞凋亡受到抑制，因此，诱导肺腺癌细胞凋亡是治疗肺腺癌的重要措施，也是降低肺癌死亡率的有力手段之一。本文以人肺腺癌A549细胞系为例，利用化学遗传学这一新兴

3、技术平台，筛选有效的诱导肺腺癌细胞凋亡的小分子化合物并研究其凋亡诱导分子机制，为进一步研究小分子凋亡诱导剂的特异性靶蛋白这一后续工作奠定基础，同时为开发新型的肺腺癌治疗药物提供理论依据。研究内容1．对小分子化合物进行初步筛选2．鉴定小分子化合物对A549细胞的凋亡诱导作用3．研究小分子化合物诱导A549细胞凋亡的分子机制研究方法1．MTT法检测细胞存活率，由此对小分子化合物进行初步筛选2．倒置相差显微镜观察细胞形态变化3．LDH(乳酸脱氢酶)检测细胞是否出现坏死4．吖啶橙染色结合激光扫描共聚焦显微镜观察，检测细胞核凝集5．TUNEL染色检测DNA片段化和凋亡率6．荧光探针D

4、CHF检测ROS表达水平7．利用TMRM染色检测细胞线粒体膜电位变化[Falchietal，2005】8．免疫荧光化学法检测膜整连蛋白134的表达研究结果1苯并嗯嗪酮衍生物对A549细胞的生长抑制作用山东大学硕士学位论文1．1MTT检测结果表明，在24h．48h内，5种苯并嗯嗪酮衍生物(1-5样)均能抑制A549细胞的生长，且其抑制作用呈现时间和浓度依赖性。1．2倒置相差显微镜观察细胞形态发现：200“M苯并嗯嗪酮衍生物(1．5撑)分别处理A549细胞24h，细胞明显缩小，有的细胞变圆。2二茂铁基吡唑并哌嗪化合物对A549细胞的凋亡诱导作用2．1MTT检测结果表明，在24h

5、-48h内，6种二茂铁基吡唑并哌嗪化合物(8a．8f)均能显著降低A549细胞的存活率并且其作用效果呈现时间和浓度依赖性。2．2倒置相差显微镜观察细胞形态发现：8d-8f各20rtM分别处理A549细胞24h-48h，细胞呈现典型的凋亡形态学特征。2．3吖啶橙染色结合激光扫描共聚焦显微镜检测细胞核片段化，发现：20山vt8d-8f分别处理A549细胞48h时，细胞核固缩、染色质凝集、凋亡小体清晰可见。2．4LDH检测发现：8d．8f各200M分别处理A549细胞48h时，与对照组细胞相比，培养液中LDH酶活浓度未发生显著性变化僻>o．05)。2．5TUNEL染色发现，8d-

6、8f各20山分别处理A549细胞48h，TUNEL染色阳性率显著升高愀0．01)。2．6使用荧光探针DCHF检测细胞内ROS水平的变化，结果发现，8d-8f各20pM分别处理A549细胞48h时，细胞内的ROS水平显著升高愀0．01)。2．7利用TMRM染色检测细胞线粒体膜电位的变化，结果显示，8d．8f各201xM分别处理A549细胞48h时，细胞内的线粒体膜电位显著升高(P

7、9细胞生长均有抑制作用，其中矿、3群和5撑化合物的抑制作用比较明显。2．MTT初步筛选结果显示，6种二茂铁基吡唑并哌嗪化合物(8a-8D对A549细胞增殖均有抑制作用，但其增殖抑制能力不同，其中8d、8e、8f--种小分子化合物增殖抑制能力较强，因此选取该三种小分子继续研究其对A549细胞的作用及其分子机制。2山东大学硕士学位论文3．8d、8e、8f=种小分子化合物20rdvl均能诱导A549细胞凋亡，而该凋亡诱导作用可能是通过提高ROS水平和影响线粒体膜电位来实现的。4．在8d、8e、8f三种小分子化合物诱导A5