GGCX在原发性膝关节骨性关节炎软骨中的表达及其意义

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1、中图分类号——分类号UDC610博士学位论文学校代码!Q533密级公珏GGCX在原发性膝关节骨性关节炎软骨中的表达及其意义ExpressionofGGCXinc硼ilageofprim哪kneeOAanditsbiologicale鼠cts作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：论文答辩日期付晓玲临床医学(外科学)骨关节湘雅二医院张湘生教授一撇臌越中南大学二O一三年五月原创性声明Ⅲ圳㈣删删舢《舢Ⅲ㈣删IY2423485本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地

2、方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：逊至日期：21三年』互日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息

3、服务。⋯础翩盼一年勤≯摘要GGCX在原发性膝关节骨性关节炎软骨中的表达及其意义中文摘要：研究目的：探讨GGCx在原发性膝关节骨性关节炎软骨中的表达及其对正常软骨细胞的生物学作用，从而为探讨其在骨性关节炎中的作用机制奠定基础。研究方法：收集20例原发性膝关节骨性关节炎和20例正常膝关节的关节软骨及关节液，对软骨进行固绿．番红0染色后进行组织学观察，并根据改良的M觚l(in评分标准对骨性关节炎关节软骨进行分组。应用免疫组化的方法检测GGCX在各组软骨组织中的表达，使用ImPCR方法检测各组软骨组织中GGCXI心mA的表达，通过westemblot检测各组

4、软骨组织中GGCX蛋白的表达，应用磁分离化学发光免疫检测法对关节液中GGCX的含量进行检测，所有数据均应用SPSS19．O软件进行统计学分析。取正常膝关节的关节软骨进行软骨细胞的分离及培养，并应用甲苯胺蓝染色和II型胶原纤维染色对软骨细胞进行鉴定。根据人GGCXmRNA序列，在线设计了三段siRNA序列，并在体外转录合成，利用LipofeCt锄ineTM2000将其转染至培养的软骨细胞，应用荧光镜检测转染效率，并使用RT．PCR方法分别检测三段si砌蛆转染后软骨细胞中GGCX砌ⅢA的表达，通过weStemblot方法分别检测三段siRNA转染后软骨细

5、胞中GGCX蛋白的表达，比较三段siRNA对软骨细胞中GGCX的干扰效率，选择干扰效率最高的siRNA片段进行1T中文摘要干扰试验。应用干扰效率最高的siRNA片段对正常软骨细胞进行转染，研究干扰正常软骨细胞中GGCX表达对软骨细胞生物学的影响。使用MTT法检测转染后软骨细胞的的增殖率，通过mmexinV．FITC&PI法检测软骨细胞的凋亡率，应用RT-PCR方法检测软骨细胞中MI、但13、X型胶原、碱性磷酸酶mRNA的表达，、张stemblot检测软骨细胞中脚13、X型胶原、碱性磷酸酶的蛋白表达，所有数据均应用SPSS19。O进行统计学分析。研究结

6、果：GGCx在正常膝关节和原发性膝关节骨性关节炎的关节软骨中均有表达，其主要位于软骨细胞的胞浆中，免疫组化的结果显示GGCX的表达在骨性关节炎软骨中明显低于正常膝关节的关节软骨(P

7、05)。为了进一步探讨GGCX对正常软骨细胞生物学的影响，我们成功设计、合成了si砌怕，并将其成功地转染至培养的软骨细胞，ImPCR和westemblot都显示我们设计的si砌叮A能显著干扰GGCX的表达，并以siI矾A片段2291干扰效率最高，随后再对干扰了GGCX表达的软骨细胞进行检测分析，结果显示：Mf、佃13、X型胶原、碱III性磷酸酶的蛋白表达及IIl】姒A都显著高于未干扰组及无意义对照组(P<0．05)；干扰了GGCX的软骨细胞在早期凋亡率、中晚期凋亡率及总凋亡率方面均明显高于未干扰组及无意义对照组(P

8、对照干扰组在O、12、24小时的细胞增殖率相对正常培养组没有明显升高(P>O．05)，但干扰GGCX表达的软