生物化学实验2

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1、生物化学实验Ⅱ实验一酶联免疫吸附试验(8学时)一、实验目的1.掌握酶联免疫吸附试验的基本方法及其原理2.学习间接竞争法检测抗原物质的基本操作二、实验原理酶联免疫吸附测定(Enzyme-LinkedImmunosorbentAsay，简称ELISA)是在免疫酶技术上发展起来的一种新型免疫测定技术，是应用酶标记的抗体(或抗原)在固相支持物表面检测未知抗原(或抗体)的方法。ELISA最常用的四种方法：直接法测定抗原；间接法测定抗体；双抗体夹心法测定抗原；竞争法测定抗原。竞争法ELISA的过程主要包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，封闭未被占据的吸附位点后，加入一定

2、量特异性抗体和样品，吸附的抗原和样品中的抗原与抗体竞争结合。再加相应酶标记抗体，生成抗原-抗体-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物，各孔的吸光度值与样品中抗原的浓度成反比。为提高检测的灵敏度，通常在酶标板上加入样品和抗体之前，先将两者以一定比例混合，于4℃预孵育16h左右。酶联免疫吸附试验是利用抗原-抗体的免疫学反应和酶的高效催化底物反应的特点，具有生物放大作用，所以反应灵敏，可检出浓度在ng水平。酶联免疫吸附试验中所使用的试剂都比较稳定，按照一定的实验程序进行测定实验结果重复性较好，有较高的准确性。酶联免疫吸附法成本低，操作简便，可同时快速测定多个样

3、品，不需要特殊的仪器设备。三、实验器材与试剂实验器材1.96孔聚苯乙烯微量细胞培养板2.八道移液器(300μL)、单道移液器(200μL、1000μL)3.电子天平4.恒温培养箱5.离心机6.酶联免疫检测仪(酶标仪)实验试剂1.包被液：0.05mol/LpH9.6碳酸缓冲液(Na2CO30.15g，NaHCO30.293g，蒸馏水稀释至100mL)，4℃保存。2.稀释液：0.01mol/LpH7.4PBS-Tween-20(NaCl8g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，Tween-200.5mL，蒸馏水加至1000mL)，4℃保存。3.洗涤液

4、：同稀释液。4.封闭液：5%豆粉，pH9.6碳酸缓冲液。5.酪蛋白溶液：15.6ng/mL、31.2ng/mL、62.5ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL和4000ng/mL。6.鲜奶。7.酪蛋白抗体，工作稀释度为1:2000。8.辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG，工作稀释度1:1000。9.邻苯二胺溶液(底物)：临用前配制。0.1mol/L柠檬酸(2.1g/100mL)6.1mL，0.2mol/LNa2HPO4·12H2O(7.163g/100mL)6.4mL，蒸馏水12.5mL，邻苯二

5、胺10mg，溶解后，临用前加30%H2O240μL。10.终止液：2mol/LH2SO4。四、操作步骤1.包被：500ng/mL酪蛋白，每孔150µL，37℃孵育1h后转入4℃冰箱放置过夜；2.洗涤：PBST洗板三次(倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽)；3.封闭：5%豆粉(离心后使用)，每孔加300µL，37℃封闭1h；4.洗涤：PBST洗板三次；5.抗原抗体反应：将一定浓度的抗体或抗体和样品的混合物加入板孔(提前预混合，4℃过夜放置)，注意从高稀释度到低稀释度加样，每孔150µL，37℃孵育2h；6.洗涤

6、：BST洗板三次；7.抗原抗体复合物与酶标二抗反应：加入酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)，每孔150µL，37℃孵育1h；8.洗涤：PBST洗板三次；9.显色：加入邻苯二胺溶液(底物)，每孔100µL，37℃，闭光反应20min；10.终止反应：每孔加50µL2mol/LH2SO4终止反应；11.测定：用酶标仪于490nm波长下测量各孔的吸光度值OD490nm；12.数据处理：将测得的吸光度值OD490nm扣除空白后，按照公式换算成抑制结合率B/B0(%)。以抑制结合率B/B0(%)为纵坐标，浓度的对数值为横坐标作图，绘制标准曲线，标准曲线用线性拟合。五、

7、注意事项1.正确洗涤酶标板，加洗涤液时要小心，勿使洗涤液溢出，流入周围孔中，造成交叉污染。洗涤后应尽量甩干孔内残液。洗涤液加入孔后，须保持3min再弃去。2.加样品时应从最高稀释度逐一加至最低稀释度，这样可以不换吸头。3.底物应在临用前配制，同时注意避光。六、思考题请查阅相关文献，指出ELISA有哪几种常用方法？各种方法在操作上有什么异同？应用有什么异同？实验二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量(8学时)一、实验目的1.学习电泳原理和技术2.学习和掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术二、实验原理蛋白质在高于或低于其等电点的