生物化学实验2 离子交换层析.ppt

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1、实验二离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶实验目的和要求1、学习离子交换层析的基本原理2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法实验基本原理1、离子交换层析由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。2、酶活力检测蔗糖酶是一种水解酶，它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。

2、（50℃水解）3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。（100℃显色）实验材料与试剂1、实验材料蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品Ⅲ）2、实验试剂⑴DEAE-SepharoseFastFlow⑵20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液⑶20mmol/LTris-HCl（1mol/LNaCl）pH7.3缓冲液⑷0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5⑸5%蔗糖溶液⑹3，5-二硝基水杨酸试剂实验器材与仪器1、高速冷冻离心机2、层析柱（φ1.0×20㎝）(1支/组）3、ÄKTATMstart（1套/组）4、部分

3、收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组）5、－20℃冰箱（保存样品用）6、微量移液枪200ul、1000ul7、1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用）8、7ml离心管（留样品Ⅳ用）9、恒温水浴（50℃、100℃）10、试管、移液管、试管架等1、仪器连接A、50ml20mmol/LTris-HCl，pH7.3缓冲液B、50ml20mmol/LTris-HCl，（0.5mol/LNaCl）pH7.3缓冲液AB1：缓冲液阀（Buffervalve）2：混和器（Mixer）3：样品阀（Samplevalve）4：泵（Pump）5：压力传感器（Pressuresensor）6：清洗

4、阀（Washvalve）7：上样阀（Injectionvalve）8：UV9：电导（Conductivity）10：出口阀（Outletvalve）开关1.接通各仪器电源，将A,B泵头分别放置A，B两个溶液瓶中。注意B为含NaCl溶液。2.点击电脑桌面上Unicorn软件图标，打开软件。选择SystemControl，点击OK，进入操作界面。点击Connect3.在操作界面的工具栏，点击MannualRun。出现FlowRate窗口，调节flowrate为1ml/min，确定。（1）连接混和器及样品阀，流速调整为1.0ml/min（2）切换至BufferB，直至Conduc

5、tivity到达40mS/cm（3）连通BufferA，直至Conductivity接近2并平稳，准备装柱BuffervalveColumnMixerSamplevalveUVConductivityOutletInjectionWashvalvePressuresensorPumpCollectorvalvevalve3、装柱和平衡：少量缓冲液DEAE-SepharoseFastFlow装柱（10min后开泵，1ml/min）平衡（流速在1.0ml/min）4cm（1）检查层析柱的两端接头，底端有膜的置于下方。（2）程序暂停。将层析柱放入卡槽，上端接头与混合器（mixer

6、)相连，下端接头与样品阀（samplevalve)相连。凝胶搅匀后灌入，待其自然沉降。若凝胶高度未达要求，需多次灌入。达到所需柱床高度后，将柱上端接头与柱连接，开始平衡。样品处理：（1）上次沉淀样品充分溶解于10ml(2*5ml)（20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液,合并为一管，两组平衡。（2）4℃12000r/min,离心10分钟，收集上清，测量体积V3，留取1ml（样品Ⅲ）用于后续分析（3）将其余样品作离子交换柱层析进一步分离纯化蔗糖酶4、加样：凝胶柱床平衡约30分钟后，待缓冲液液面与胶体表面相切时，程序暂停pause。旋开柱上方接头，用胶头滴管缓慢将蔗糖

7、酶蛋白样品溶液（样品Ⅲ）加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可能保持胶面平整。启动程序，使样品溶液进入胶体，待样品溶液完全进入胶体后，暂停程序，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下，并完全进入胶体后，再加缓冲液至一定高度，盖上柱上方接头。再次启动程序。样品缓冲液5、洗脱（梯度洗脱法）：（1）加样后，先用A缓冲液进行洗脱，洗去未被凝胶吸附的杂蛋白（20min左右）；（2）待层析柱流出液在仪器上绘出的基线稳定，在程序主界面的工具栏Manual→Executemanualinstruction→pumps→Gra