PKIP在大鼠肝纤维化发生机制中的作用研究

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1、中文摘要RKIP在大鼠肝纤维化发生机制中的作用研究摘要肝纤维化(hepaticfibrosis)是肝硬化乃至肝功能衰竭的共同病理基础和必经阶段，是影响慢性肝病的重要环节，因此肝纤维化的预防、治疗乃至逆转是阻断肝硬化的关键环节。肝纤维化也成为国内外学者研究慢性肝病的焦点。我国是肝病高发国家，以慢性乙型、丙型病毒性肝炎最为常见，在目前尚无良好的抗病毒药物的情况下，阻止或逆转肝纤维化进程成为治疗慢性肝病的重要对策。生理状态下，HSCs在维生素A代谢和维持肝脏构架(产生细胞外间质和通过收缩作用调节窦状隙血流)中起重要作用。在慢性肝损伤过程中HSCs经历了表型转

2、化(激活)，变成了高增殖活性的类维生素A缺乏细胞(表达Gt．SMa)，激活的HSCs在肝纤维化，肝硬化，门脉高压和肝癌形成过程中具有重要的作用。激活的HSCs获得不断增殖，合成大量的ECM分子，分泌细胞因子和生长因子，迁移和收缩的能力。肝星状细胞在塑料培养皿中进行体外培养时使HSCs的活化过程得到很好地重现。在肝纤维化和肝硬化过程中，Raf-1／MEK／ERKl，2信号通路处于激活状态。Ra￡1／ME班RKl，2信号通路的激活可以促进细胞生长，分化和迁移。许多不同的生长因子受体，包括PDGF和EGF受体通过小G蛋白Ras结合和聚集Raf-1激酶进而激活

3、ERK／MAPK信号通路。Raf-1磷酸化MEK接着磷酸化和激活ERK。磷酸化的ERK进入细胞核通过结合多种转录因子来调节基因表达，进而促进了致纤维化蛋白分子的表达。Yeung和他的同事们首次证明RKIP通过直接与Raf-l上的激酶位点相互作用抑制ERK／MAPK信号通路。RKIP是广泛表达的高度保守的胞浆蛋白，与其它的激酶抑制剂没有同源性，是人们目前发现的唯一的Raf-1蛋白天然抑制剂。在非磷酸状态下，RKIP通过与Raf-1结合阻止Raf-1磷酸化，干扰Raf／MEK结合，抑制MEK和下游分子的活化来达到负向调节蹦：l小也班IⅨl，2信号通路的作用

4、。磷酸化的RKIP从Raf-1上解离出来与GRK-2结合并阻断其活性，GRK-2是G蛋白偶联受体(GPCRs)的负反馈抑制蛋白。GRK-2使GPCRs磷酸化，从而将G蛋白与GPCRs中文摘要解离导致G蛋白信号通路的活化。有数据表明RKIP被PKC磷酸化后能同时激活Raf-1／MEK／ERKl，2和GPCR信号通路。近些年来，RKIP被证明是一个抑制肿瘤细胞侵袭扩散的蛋白分子，包括前列腺癌，恶性黑色素瘤，乳腺癌，胰岛细胞癌，直肠癌和肝癌。RKIP在MDCK表皮细胞中的作用则相反，RKIP过表达能使MDCK由表皮细胞转化为成纤维样细胞并且促进细胞迁移。Lo

5、costatin(是一种不具有抗菌作用的黄恶唑酮衍生物)能够特异地消除RKIP对Raf-1的抑制作用，同时也是MDCK表皮细胞迁移抑制剂。进一步的研究证明RKIP在正向调节细胞与基层黏附和负向调节细胞与细胞的黏附过程中具有重要作用。HSCs细胞形态改变和运动迁移构成了一系列肝纤维化生物过程的重要部分。尽管RKIP在MDCK表皮细胞和高侵袭力肿瘤细胞中的作用已经得到揭示，但是RKIP在肝纤维化形成时HSCs中的作用却知之甚少。在本实验中，我们将揭示RKIP在肝纤维化组织的表达及其在HSCs细胞增殖和迁移中的作用。实验内容主要包括以下3部分：第一部分：肝纤

6、维化大鼠肝组织中RKIP、p-RKIP、ERK和p-ERK的动态表达情况目的：研究RKIP在胆总管结扎肝纤维化大鼠肝脏组织的表达情况。方法：运用胆总管结扎方法制作大鼠肝纤维化模型，模型组分别于结扎后l周、2周、3周、4周麻醉动物，假手术组与4周模型组同批麻醉，留取肝脏标本。组织切片经HE和Masson三色染色检测病理变化，Westernblot和免疫组织化学方法检测RKIP在肝组织的表达，用Westernblot方法检测RKIP和ERK的磷酸化水平。结果：①HE和Masson三色染色结果证明胆总管结扎大鼠肝纤维化模型制作成功。②RKIP在大鼠肝组织的免

7、疫组织化学定位：RKIP在正常大鼠肝组织的肝细胞、胆管周围细胞、血管内皮细胞和肝窦周围细胞中均有表达，分布在细胞胞浆和胞膜；随着肝纤维化的发展，大鼠肝脏中RKIP阳性细胞明显减少，与肝细胞相比RKIP在汇管区和纤维间隔的成维细胞中表达较少，但在肝细胞胞膜中的表达增强。造模1--4周大鼠肝组织RKIP的阳性面积占总面积的百分比分别为(87．15：1．4)％，(77．25：2．2)％，(60．9±2．3)％和(48．2±2．2)％；2--4周大鼠肝组织RKIP的表达显著性低于正常对照组(89．25：1．3)％，P<0．05。③Westernblot分析结果

8、显示，RKIP中文摘要在模型组3~4周肝纤维化组织的表达较假手术组下降，假手术组(105．7±