甘草甜素在肝纤维化中作用机制的研究

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1、甘草甜索在肝纤维化中作用机制的研究研究牛导帅f．．占凌张连。怪娜州足学第附腻医院消化内科j。U1白郑州1j0(152中文摘要背景和日的：1』J纤维化赴各种“蛆⋯扦绢川Jf硬化发腱的必经过{I!，它产生的蝻理学坫㈣赴1jr细怡外j．￡J矗fexlracellularmaIrjx，EcM)的叫·成和降州失衡，敛使细J地外挂肛的世J耍J’。牛披啦肝叭的片常扫[秘。，1pf究证吱盯j!状钏m(hepaIicsIellatecell，Hscl址r。牛爿叫世外J．￡质阳j：蛆术渊，"JJ『i{爱到持j伤⋯誊的刺激f-’激活盯砒状细J也，导致钏胞外瞒质的过耻，“

2、。1．。J¨=^!状钏抛的激汁址吖纤维化发乍杓-hC、环仃，浚钏眦的{^化址Ⅲ纤维化蜮终呐I¨4通蚺。这址我{¨选择⋯耻状钏t他们?为研究盯纤维化靶细j旭的州沦』点舢。水吱验所选药物川r’甜袭fGlycyrrhizm)址川·寸似享『勺捉取物，。E赶"⋯，’·：玖腋雨¨Ⅱ‘0椭雌舱的儿jjJJ化含物，儿fJ抗拟形衍f』抗俩海等多种协川，札临床川J‘肝脏力I=_的治盯L仃√余勺：。近术研宄发现1“1ij崇存肝j}1_维化⋯甜淆咔·也Ⅲ样U仃}&并疗效。{‘t．_iu豢虽然斌过不问的的材呲0^乏选释祚】¨_纤绯化·ft发挥效用，{_}=l它抗肝}r维化的

3、钏胞宁7椰分J’生物学机制仍然木搬灯的嘲lW。为进步探讨”事甜索存肝纤维化巾作刚的细胞学和分子生物学机制，术实验通过川州忡能比色央验法(盯T“ssdv)椿L寸”·。?i甜誊对Ij{=h2状钏地增蛳的蟛114；利用抑制性消减杂交(supprcssionsubtfactivehybridiza“on，ssH)技术构遵甘卓甜豢处理后的肝星状细胞靶基因的cn～^消减文库及筛选肝星状细胞的革_=!基凶，旨在从细胞学和分子生物学角度探讨廿草甜素在肝纤维化中的作用机制，为甘草甜素在肝纤维化的应用提供新的理论依据。方法：l甘草甜素处删引星状细胞，通过显微镜观察廿学

4、甜素对体外培养肝星状细胞生长状态、细胞形态学影响，前绘出牛长曲线：同时用四唑赫比色实验(M711T法)了解甘草甜素对肝星状细胞的增殖影响的量效关系。2．以甘草甜素处理的肝星状细胞作为实验组，术用甘草甜素作用的相刚细胞系作郑州人学20061l1㈣I’!#化沦史·‰f紊仆肝纤维化中作用机制的Ⅲ究为对照组：24h后制备细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经I{saI酶切后，将实验组cDNA分成曲组，分别与两种升i同的接头衔接，再‘j列j姒纠c1]NA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(I，cR)，将产物与T／A载体连接，构建c卟A消减文库，

5、并转染大肠杆菌DH5n进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。3．以末刚lj={荦舌f}素处理的相同细胞系作为实验组，甘草甜熏处理的肝星状细胞作为刈照组；24h后制备绌胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaI酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别’j两种／1i嗣的接头衔接，再与对照组cD姒进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PcR)，将产物与’l、／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌叫5o进行文库扩增，随机挑选克隆PcR扩增后进行测序及同源性分析。结果：1．H草甜素浓度在O．6mm01几以卜时，在

6、体外能抑制肝星状细胞的增殖，日．随其浓度的增JJ【l、作用时问的延K，抑制效果越显著；¨草甜索亦可引起肝星状细胞彤念学改变。2．成功构建叶草甜素处理的肝星状细胞上调基因的差片表达c-【)NA消减文库。文库扩增后得剑36个附皑二克隆，进行荫落Pc】}分析，均得剑2001000bp捅入片段。随机选择20个克隆，对插入片段隆进行测序，并通过生物信息学分忻筛选出l2个已知上调基因序列。3．成功构建汁草甜素处理的肝星状细胞下调基因的差片表达cDNA消减文库。文库扩增后得到15个阳性克隆，进行菌落PCR分析，均得到2001000bp插入片段。随机选择I()个克

7、降，对插入片段隆进行测序，并通过生物信息学分析筛选m4个已知下调基因序列。结论：1．甘草甜素对肝星状细胞的增殖具有抑制作用，而且具有剂量、时问效应。抑制肝星状细胞的增殖可能是甘草甜素的抗肝纤维化作用机制之一。2．证实甘草甜素可上调肝星状细胞已知基因的表达，其中筛选到的上调基因铁蛋白重链(ferritin，heavypolypeptide)、透明质酸介导的细胞运动受体(receDtorforhyaluronan—mediatedmotility，RHAMM)、B一胡萝h素一15，157一双加氧酶(beta—carotene15，15’一dioxyge

8、nase)可通过不同的机制抑制肝星状细胞的增殖，铁蛋白重链还具有抗氧化应激作用而保护细胞免受氧化损伤。推测甘草甜素可促使以