调控Nrf2ARE通路对小鼠脊髓损伤治疗作用的实验研究

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1、南京大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下独立进行的研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注引用的内容外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：名j．日期：少f(，f．1平／和沙’‘南京大学学位论文使用授权声明本学位论文作者同意学校保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸

2、质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容。论文的公布(包括刊登)授权南京大学研究生院办理。一签名≮：k导师虢奠弧岛日期咖¨，z≯南京大学博士学位论文调控Nrf2-ARE通路对小鼠脊髓损伤治疗作用的实验研究前言㈣Y23㈣日!J舌723S芝脊髓损伤(Spinalcordinjury，SCI)是战争及日常生活中较常见的创伤类型，致残、致死率均较高。随着国家城市化进程的不断深入，发病率逐渐上升，其导致的肢体功能障碍及排便、排尿功能障碍严重影响患

3、者的生存质量，给家庭和社会带来沉重的经济负担。如何减轻并改善脊髓损伤后的神经功能障碍，始终是国内外研究的重点及难点，而目前临床上治疗急性脊髓损伤仍缺乏确实有效且相对安全的药物。究其原因，主要有以下两个方面：(1)脊髓原发性损伤后导致的继发性神经元损伤机制极为复杂，包括兴奋性氨基酸毒性作用、细胞凋亡、炎症反应、钙离子超载、脱髓鞘、轴突退变等。这些发病机制错综复杂，且相互影响、相互促进，形成一个巨大的复杂网络。目前临床上实验的药物很难同时作用于多种损伤机制，从而打破各机制之间的相互影响，故疗效甚微；(2)过

4、度一味地遏制某些继发性损伤机制而忽略其对机体有利的一面，反而会带来副作用。例如早期剧烈的炎症反应会加重机体的损伤，但炎症反应后期则对坏死组织的清除、机体的修复有利。如果在治疗上过度一味的遏制炎症反应，就会影响机体自身的抵御与修复能力，反而导致炎症扩散，病情加重。因此，我们试图寻找一个新的治疗靶点，作用于这个新靶点能激活机体内在的调控机制，使各种应激反应存在于一定的程度和范围之内，避免过度损伤而又不影响机体自身的恢复，并且作用于该靶点可以同时干预多种继发性神经元损伤机制，打破网络中各机制之间的相互影响，避

5、免以往治疗的片面性。Nrf2一ARE通路可能就符合这样的要求。核因子E2相关因子2(NuclearfactorE2一relatedfactor2，Nrf2)是一种新发现的转录因子。生理状态下它与胞浆蛋白伴侣分子(Kelch—likeECH-associatedproteinl，Keapl)结合使活性处于相对抑制状态。在应激、感染、创伤等刺激或某些化学物质如莱菔硫烷的作用下，Nrf2与Keapl解偶联，后转移入细胞核，与抗氧化反应元件(Antioxidantresponseelement，ARE)结合，启

6、动ARE调控的一系列保护性分子的表达，增加细胞对各种刺激的抵抗力。Nrf2-ARE通路是细胞内在的一种调节机制，研究表明，该通路激活后，会表达II相解毒酶、抗氧化酶、抗炎蛋白、调节钙离子稳态相关蛋白、生长因子、DNA修复酶等下游分子，它们恰恰涵盖了脊髓损伤后多种重要的继发性损伤的防御机制，包括抗氧化应激、调节炎症损伤、拮抗细胞凋亡、缓解钙离子超载等，从多个方面起到保护细胞的作用。Nrf2-ARE通路具备两个特点：(1)该通路是细胞内在的一种保护调节机制，调控该通路治疗脊髓损伤的方案可能更符合生理反南京大

7、学博士学位论文调控Nrf2-ARE通路对小鼠脊髓损伤治疗作用的实验研究应过程，而非以往药物治疗单纯一味抑制某种病理生理机制；(2)激活该通路，可以使机体同时表达多种保护性蛋白，且这些蛋白可以发挥协同作用，从抗脂质过氧化、维持钙离子稳态、调控炎症反应、减轻细胞凋亡等多方面起到保护细胞的作用。所以我们设想，以Nrf2一ARE通路作为治疗脊髓损伤的新靶点可能会起到较好的神经功能保护作用。为证实这一设想，本课题一方面正向调控Nrf2-ARE通路，利用该通路激动剂莱菔硫烷(Sulforaphane，SFN)治疗小

8、鼠脊髓损伤，证实SFN通过增加该通路下游抗氧化／解毒酶的表达及活性，并同时通过调节炎症反应，来减轻小鼠脊髓损伤后的脊髓水肿及神经功能障碍；另一方面反向调控Nrf2-ARE通路，利用Nrf2基因敲除小鼠建立SCI模型，证实将Nrf2敲除后，失去Nrf2的保护，该通路下游抗氧化／解毒酶的表达及活性下降，受损脊髓内的炎症反应更为剧烈，脊髓损伤后的神经功能障碍更为严重。本研究为找寻临床治疗脊髓损伤的新靶点及新药物提供了理论依据和实验基础。II南京大