苹果渣与棉粕固态发酵生产NSP酶的研究

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1、山东农业大学博士学位论文苹果渣与棉粕固态发酵生产NSP酶的研究姓名：孙中涛申请学位级别：博士专业：生物化学与分子生物学指导教师：杜金华20081208山东农业大学博士学位论文中文摘要苹果渣与棉粕产量巨大，但目前尚未对其进行充分的综合利用，这不仅是资源的浪费，也带来了环境污染问题。另一方面发酵工业普遍采用的常规原料，如淀粉、葡萄糖、蔗糖等碳源，豆粕、麸皮、蛋白胨等氮源，近年来缺口很大，价格飞升，导致发酵产品成本上升，很多附加值较低的产品出现亏损。因此，本文拟将碳水化合物含量丰富的苹果渣与蛋白质含量丰

2、富的棉粕用作碳源与氮源，部分取代常规发酵原料，生产NSP酶，以降低生产成本，部分解决发酵工业与入争粮、与畜争饲的问题，提升这些残渣资源的价值，同时也有利于环境保护。1、棉酚对微生物的影响及其生物脱毒以棉粕作为发酵原料，必须考虑棉酚对发酵过程的影响与产品中棉酚的残留问题。研究结果表明，棉酚对米曲霉F5、黑曲霉HG．1、黑曲霉Fl、黑曲霉F2、黑曲霉F3、米曲霉F4等真菌孢子的萌发具有一定的抑制作用。在孢子萌发的初期，抑制效应比较明显，在6h时，含棉酚lO¨．g／mL的培养基中米曲霉F5孢子的萌发率仅

3、为对照的36．4％，但随着时间的延长，这种抑制效应不再明显，这说明棉酚只能抑制孢子的萌发，但不能杀死孢子。棉酚对真菌菌丝的生长具有一定的影响，但未达到显著水平，棉酚含量为lOpg／mL的培养基中菌丝生长没有受到明显的抑制。实验所采用的微生物对棉粕脱毒都有一定的效果，但不同菌种以及同一菌种的不同菌株之间棉酚脱毒能力相差很大，其中自地霉G07的脱毒能力最强。采用Plaekett-Burman实验设计与响应面实验设计对白地霉G07固态发酵棉粕脱毒的工艺进行了优化，结果标明，最佳培养基组成为1．63％(w

4、／w)(NH4)2S04，0．10％(w／w)KH2P04，0．05％(w／w)MnSOa，0．1％(w／w)MgS04，0．2％(w／w)CaCl2，初始含水量为62．19％(w／w)。在上述最佳培养基中，300C培养48h，基质中自由棉酚的含量由144．0肛∥g下降至30．42“∥g，这表明白地霉G07具有较高的棉酚脱毒能力。对干重减重与棉酚残留量的回归分析表明，在0---'48h期间，棉酚脱毒率与菌体生长呈高度线性相关。体外消化实验表明，生物脱毒样品中的结合棉酚比FeS04脱毒样品中的结合棉

5、酚在体外消化过程中更稳定，也就是生物脱毒样品比FeS04脱毒样品的安全性要高。生物脱毒后棉粕的营养价值得到了提高，粗蛋白与精蛋白含量提高显著，分别达12．6％与19．7％：氨基酸总量与必需氨基酸含量也大幅度提高，分别达17．O％与36．4％，蛋氨酸、苹果渣与棉粕固态发酵生产NSP酶的研究赖氨酸与苏氨酸含量分别提高46．9％，21．0％与59．3％。2、黑曲霉HG．1固态发酵生产果胶酶苹果渣中果胶含量高，可诱导微生物分泌大量的果胶酶，是生产果胶酶的良好原料。本文选用果胶酶产量较高的黑曲霉HG·1为生

6、产菌种，采用单因子实验和正交实验对其固态发酵工艺进行优化，结果表明，最适产酶培养基为苹果渣109、棉粕109、(NH4)2S040．29、K2HP040．069、初始水分含量60％；最佳装料量为每瓶209干料，30。C恒温培养48h，果胶酶酶活力可达22248U／g。同时，对所产果胶酶的酶学性质进行了初步研究，结果表明，该酶酶促反应最适温度为45。C，最适pH为5．O：在504C以下，pH3．0～6．0时稳定性良好；ca2+、Mg+、Fe2+对该酶有激活作用，而Ba2+、Mrl2+、Zn2+有抑制

7、作用。3、黑曲霉F1与F3固态混菌发酵生产果胶酶、蛋白酶与纤维素酶与单一菌种发酵相比，混菌发酵具有更多的优势，多菌种在基质利用能力上互相补充，可以在价格低廉、营养组成复杂的基质上良好生长。本文所采用的两株黑曲霉具有不同的酶系，黑曲霉Fl虽然对纤维素类物质的具有很强的分解能力，但在以棉粕为氮源的发酵体系中，相对较弱的蛋白质分解能力成为其生长的限制性因素；与此相反，黑曲霉F3虽然对蛋白质的分解能力很强，但在以苹果渣为碳源的发酵体系中，相对较弱的纤维素类物质的分解能力成为其生长的限制性因素；二者进行混菌

8、发酵时，酶系作用互补，双方均可得到更好的生长，发酵产物的酶系组成更为合理，既有纤维素类物质的水解酶类，也含有蛋白质的水解酶类，同时，酶活水平更高。研究结果表明，混菌发酵的最佳培养基组成为苹果渣与棉粕1：l(w／w)，(NH4)2S04l％(w／w)，KH2P040．1％(w／w)，黑曲霉F1与F3最佳配比为2：1(w／w)，接种量O．4％(w／w)，30"C恒温培养48h；果胶酶、蛋白酶、和纤维素酶活力分别达到21168U／g，3585U／g和1208U／g。除蛋白质含量较低外，苹