大肠杆菌鸟苷酸还原酶基因的克隆、表达与同源重组研究

《大肠杆菌鸟苷酸还原酶基因的克隆、表达与同源重组研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、华东理工大学硕士学位论文第I页大肠杆菌鸟昔酸还原酶基因的克隆、表达与同源重组研究摘要以E.coliMC4100染色体DNA为模板用PCR扩增技术克隆了鸟昔酸还原酶基因guar，该基因位于大肠杆菌K-12株染色体的2.6分钟处，该基因全长1044bp，编码了分子量为37kD的蛋白质。将该基因直接克隆于pET16-b质粒的T7启动子下游，得到了质粒pEXPI。转化E.coliBL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖昔CIPTG)诱导，获得了高效的表达。含表达质粒的菌体的胞内粗提液经酶活分析表明，鸟昔酸还原酶的

2、活性为不含质粒的宿主菌的80^85倍。另一方面，为了获得鸟昔酸的积累，针对大肠杆菌体内的鸟昔酸代谢途径，进行了guaC基因敲除的探索工作。为了获得较好的同源整合的效率，在被灭活的目的基因guaC基因的两侧进行了PCR扩增，以获得较长的同源序列。与此同时建立了筛选同源整合菌株的模型并且确立了筛选同源整合菌株的条件。关键词:guaC基因，鸟普酸还原酶，基因表达，基因敲除第且页华东理工大学硕士学位论文StudiesonCloning,ExpressionandKnockoutoftheGeneEncoding

3、theGMPReductaseinEscherichiacoliAbstractThegeneencodingGMPreductasewasclonedfromE.coliMC4100bypolymerasechainreaction(PCR).Thisgene,onthephysicalmapof2.6min,comprises1044bp,anditencodesapolypeptideofM,37kD.ThegenewasinsertedintothedownstreamoftheT7promot

4、erofplasmidpET16-bandrecombinantpEXPIwasobtained,whichwastransformedintoE.coliBL2I(DE3).TherewasoverexpressionundertheinductionbyIPTG.TheenzymeassayshowedthattheactivityofGNPreductasewasincreasedto80^85foldsintherecombinationstrain.Atthesametime,inordert

5、oachievehighyieldofGNP,researchongeneknockoutwasconductedonthebasisofnucleotidemetabolicpathwaysinthe丑coli.TheDNAfragmentsonupstreamanddownstreamofguaCgenewereclonedbyPCRsoastohavehigheficiency.Finally,therecombinationmodelandconditionswereestablished.Ke

6、ywords:guaCGMTReductase,GeneExpression,GeneKnockout作者声明我郑重声明:本人悟守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的结果。除文中明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何他人已经发表或撰写过的内容。论文为本人亲自撰写，并对所写内容负责。论文作者签名:座革找)110}2年,2月NI日华东理工大学硕士学位论文第1页第1章综述与导言1.1核酸类物质的应用价值核昔酸类物质是极其重要的一类生物物质，在生物体内执行着

7、相当重要的生物学功能。核昔酸对正常发育和生长、胃肠道的修复和维持细胞免疫作用十分明显【日。又如鸟PT吟核普酸类物质，在生物体内与蛋白质的合成、RNA的代谢和细胞的循环有着密不可分的关系〔，，。人们通过研究发现人乳中有包括五种5’一核营酸，分别为:5’一单磷酸鸟普(GMP);5’-单磷酸肌昔(IMP);5’一单磷酸尿若(VMP);5'一单磷酸胞zf}(CMP);5'一单磷酸腺昔(AMP)，从而使人乳在喂食婴儿时具有对抗细菌性病菌的纯天然免疫能力。由此可见5'一核昔酸的生理活性，其功能性不言而喻。在成年人营

8、养食品中添加核昔酸，从加强免疫功能考虑，也是非常行之有效的方法。人类的T细胞要正常成熟并具有吞噬功能需要提供一定量的核普酸易受霉菌感染和抗细菌能力降低经常是由于饮食中缺乏核昔酸，如在食品中加入RNA就能阻止易受病菌攻击而引起的感染。在蛋白质严重丧失后，单依靠提供充裕的能量和蛋白质并不能恢复正常的免疫功能，而饮食核普酸能够恢复失去的免疫功能。同时核昔酸类物质在食品中还是极重要的调味品物质。“食无定味，适者为珍’，，这句中国食文化的古训颇为人们