基于大肠杆菌xyla和xylb基因的克隆与表达

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1、一心啊咧⑨天毕大薯硕士学位论文～-0■■啊■0■毒-薯毒●哪一■¨i学科专业：化学_工艺7作者姓名：洪解放指导教师：张敏华+教授天津大学研究生院2005年1月中文摘要随着人们对全球性能源危机认识的不断加深及环境保护意识的不断加强，开发新的替代能源已是刻不容缓的重大战略问题。生物乙醇作为一种可再生的替代能源，同益受到各国的重视。如何利用廉价生物质等可再生资源进行生物乙醇生产已成为各国的研究热点之一。本中心在这样的背景下进行Zymomonasmobilis基因工程改造，使其能发酵木糖生产乙醇。本文研究内容为中心大课题的一部分，即克隆并表达大肠杆菌木糖异构酶基因(xylA

2、)与木酮糖激酶基因(xylB)。首先通过紫外诱变、Ap富集与X—EMB平板筛选得到木糖营养缺陷型菌株787。通过PCR反应克隆大肠杆菌K12xylAB，PCR产物以pBSKS(+)为载体引入菌株787，经筛选平板筛选和转化子酶活测定判断克隆得到的DNA片段即为目的片段xylAB。测序结果进一步证明克隆得到的DNA片段为目的片段xylAB。然后将xylAB与穿梭质粒pZBl相连构建成pZBI-xylAB质粒，并转化DH5a与Z．mobilisCP4。最后，利用PCR重叠延伸技术将大肠杆菌xylAB自身的启动子换成Z．mobil&CP4的gap基因的启动子，构建成pZB

3、I—Pgap-xylAB，并分别转化DH5Q与Z．mobilisCP4。通过半胱氨酸一咔唑的方法测定菌株粗酶液的XI酶活，D一木酮糖一NADH耦联法测定XK酶活，结果表明：大肠杆菌DH5a(pZBl-xylAB)XI酶活为DH5d(pZBl)的2倍，而XK酶活为DH5QQzBl)的100倍，DH5a0zBl-Pgap-xylAB)的XI酶活是DH5n(pZBl)的3倍，而XK酶活约为DH5a(pZBl)的824倍；说明运动发酵单胞菌gap基因的启动子也能被大肠杆菌有效识别并启动转录。关键词：木糖营养缺陷型木糖异构酶基因木酮糖激酶基因PCR重叠延伸技术基因表达酶活测定

4、ABsTRACTABSTRACTWiththegraduaterecongizationfortheglobalenergycrisisandenvironmentalprotection，itisurgenttofindallappropriatesubstitutetoreplacethepetroleum．Bio—ethanol，beingmadefromrenewableresources，couldbeusedasfuelandchemicalsandissuchasubstitute．Screeningorconstructingavaluablemic

5、robialstrain，whichconvertsbiomassfeedstockstobio—ethanolbyfermentationeffenciently，isanimportantjobinbio—ethanolindustry．uhdersuchcircumstances．theprojectofconstructinghybridstrainswhichmetabolitepentoseforbio—ethanolproductionhasbeensetup，withthepurposetoaltematethetraitofZymomonasmob

6、ilisbymeansofgeneticmanipulation．Theworkinthispaper，cloningEscherichiacoliK12xylABandexpressingtheminZymomonasmobilisCP4，isaportionofthewholeproject．First，thewildtypestrainE．coliCSH25—1wasirradiatedbyUV．Aftertwiceampicillinenrichment，xyloseauxotraphmutantswerescreenedonx—EMB(xylose—eos

7、inmethylerieblue)selectiveplatesandidentifiedbyenzymeactivity．Second，xy／ABgeneWasobtainedbymeansofPCR，andintroducedintoxylosedeficientstrain787whilepBSKS(+)Wasusedasavector．TheXI、XKactivitydeterminationandthesequenceanalysisrevealedthetransformanthavingtherightgeneswewanted．Finally,t