大肠杆菌mn-sod基因的克隆及表达

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1、大肠杆菌Mn-SOD基因的克隆及表达作者：李佩珍，张洪勤，应俊，李东【摘要】目的:实现Mn-SOD基因在大肠杆菌（E.coli）中的可溶性表达，并对表达产物进行活性测定。方法：用PCR方法从大肠杆菌2号基因组中扩增Mn-SOD基因编码区，克隆到pUCm-TVector，测定核苷酸序列；再将基因编码区克隆到原核表达载体PET-28a，构建含Mn-SOD基因的重组表达质粒，转化到大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达。结果：SDS-PAGE分析表明SOD的表达量约为细菌总蛋白的50%；黄嘌呤氧化酶法测定表达蛋白活性，菌体可溶性总蛋白中表达产物酶比活为3921.8U/

2、mg，是对照BL21的276.8倍。结论：Mn-SOD基因可在BL21中成功表达，产物具有高可溶性、高活性的特点。【关键词】大肠杆菌；Mn-SOD；原核表达；活性测定Abstract:Objective:ToachievethesolubleexpressionofMn-SODgeneinE.coliandassaytheenzymeactivityoftheexpressedproduct.Methods:ThecodingregionofsuperoxidedismutasewasamplifiedusingPCRmethodfromtheE.coligen

3、ome.ThePCRproductwasclonedintoPUC19-Tvectorandsequenced.Inaddition，theclonedcodingregionofMn-SODwasinsertedintotheexpressionvectorPET-28atoformtherecombinantplasmid10PET-28a-Mn-SODandwasthentransformedintoE.coliBL21forexpression.Results:TheSDS-PAGEanalysisrevealedthattheexpressionrec

4、ombinantSODaccumulatedupto50%ofthetotalbacterialprotein.TheenzymeactivityofMn-SODwasassayedwithxanthineoxidasemethod.Theresultshowedthatthespecificactivityoftheexpressedproductinthetotalsolubleproteinwas3921.77U/mg，andwas276.77timesof.E.coliBL21.Conclusion：Mn-SODgenecanbesuccessfully

5、expressedinE.coliproductshatethechardcteristicsofhighsolubihityardhighactivity.Keywords:E.coli；Mn-SOD；prokaryoticexpression；enzymeactivity超氧化物歧化酶(superoxide10dismutase，SOD)是细胞体内歧化超氧阴离子自由基(O-2)的一个抗氧化酶，按其结合的金属性离子根据其中金属辅基的不同可分为4类：Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD，它们通过催化超氧阴离子自由基0-2发生歧化反应，达到

6、清除O-2的效果，具有防御氧毒性、增强机体抗辐射损伤能力、防衰老以及治疗某些肿瘤、炎症、自身免疫疾病等功效，广受国内外科研工作者的关注和重视[1]。通过转SOD基因技术实现SOD的大规模发酵生产，具有良好的应用前景。本研究运用分子生物学技术对大肠杆菌Mn-SOD基因的全长编码序列进行克隆，采用原核表达技术对其进行原核表达，应用SOD酶活测定进行表达产物的酶活鉴定，成功地实现了Mn-SOD基因的克隆和表达，为该基因的下一步研究和应用打下了良好的基础。1材料和方法1.1质粒及菌种E.coliJM109、E.coliBL21、PET-28a为本实验室保存；PUCm-T

7、载体购自上海生工生物工程技术服务有限公司。1.2试剂各种限制性内切酶，T4DNALigase、RNAase、溶菌酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司，100bpMarker购自北京晶美生物工程有限公司，DNA片段回收试剂盒(UNlQ-10Kit)、质粒抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司，超氧化物歧化酶测试盒购自南京建成生物工程研究所。1.3引物设计从Genbank中找到大肠杆菌Mn-SOD基因全长序列，用Primer3.0软件设计引物：上游引物序列为5’-TGTGAATTCTATACCCTGCCATCCCTG-3’，下游引物序列为：5’-AGTAA

8、GCTTGCAGGCGG