酵母双杂交技术筛选与Fbxl16相互作用的蛋白质

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1、酵母双杂交技术筛选与Fbxl16相互作用的蛋白质【摘要】目的:寻找体内能够与Fbxl16相互作用的蛋白质,用以揭示该蛋白的功能及其在脊髓损伤修复过程中的作用.方法:通过RTPCR技术克隆scirr1基因编码区序列,将其克隆入pSos载体以构建质粒pSosscirr1.把该重组质粒表达的融合蛋白hSosFbxl16作为诱饵蛋白,用改良的酵母双杂交技术筛选大鼠脑cDNA文库中能与Fbxl16相互作用的蛋白质,最后用酵母双杂交回转实验对获得的相互作用的可靠性加以验证.结果:成功构建了融合蛋白表达质粒pSosscirr1之后,筛选出了14个与Fb

2、xl16阳性相互作用的蛋白质；通过回转实验验证,确定其中两个蛋白能与Fbxl16相互作用,分别是cAMP依赖蛋白激酶α型催化亚基（proteinkinase,cAMPdependent,catalytic,alpha,Prkaca)和衣被蛋白复合物ζ亚基（coatomerproteincomplex,subunitzeta1,Copz1).结论:Fbxl16和Prkaca的相互作用为解释cAMP通路与脊髓损伤的关系提供了新思路，提示Fbxl16与细胞内物质转运有关.【关键词】脊髓损伤Fbxl16蛋白质相互作用PrkacaCopz10引言7Fbx

3、l16,又称Scirr1,是一个新发现的蛋白质,计算生物学研究结果表明它具有“Fbox+LRR”结构域,在脊髓损伤后表达明显增加［1］.为了研究该蛋白的功能以及在脊髓损伤修复中的作用,我们通过RTPCR技术克隆出scirr1基因编码区序列,将其克隆入pSos载体以构建质粒pSosscirr1.把该重组质粒表达的融合蛋白hSosFbxl16作为诱饵蛋白,用改良的酵母双杂交技术筛选大鼠脑cDNA文库中能与Fbxl16相互作用的蛋白质,最后用酵母双杂交回转实验对获得的相互作用的可靠性加以验证,以期找到能与Fbxl16相互作用的蛋白质.1材料和方

4、法1.1材料成年雄性Wistar大鼠1只,体质量220~250g,由军事医学科学院提供.PCR引物由上海生工合成.质粒提取和PCR产物回收试剂盒购自Stratagene公司.TaqDNA聚合酶、DNA连接酶、NcoI和SalI内切酶购自Qiagen公司.酵母双杂交试剂盒CytoTrapXRPremadeLibrarieskit购自Stratagene公司.1.2方法1.2.1RTPCR克隆scirr1基因编码区序列用Trizol方法提取大鼠脊髓总RNA；上、下游分别引入NcoI和SalI酶切位点设计scirr1引物,上游：5GAGCCATG

5、GTGATGTCGAGCCCTGGTATC73,下游：5GACGTCGACCTATTCAATGACGAGGCAGC3,RTPCR扩增scirr1基因编码区.用10g/L琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物,按标准程序纯化回收以及酶切目的条带中的DNA产物,送上海生工测序.1.2.2构建融合表达质粒扩大培养pSos质粒的保存菌种,采用DNA抽提试剂盒提取pSos质粒,用NcoI/SalI双酶切并纯化回收质粒.将线性化质粒和酶切后的scirr1编码区DNA行10g/L琼脂糖凝胶电泳,成像拍照后,采用TotalLab软件进行定量.将线性化质粒和酶切后的

6、scirr1编码区DNA按照1∶7的摩尔比进行重组连接,将重组载体转化感受态BL21型大肠杆菌,酶切鉴定后送上海测序鉴定.1.2.3酵母双杂交文库筛选使用诱饵质粒pSosscirr1,温度敏感型cdc25H酵母突变株和5个对照质粒(pSos,pMyrLaminC,pSosMAFB,pMyrMAFB和pMyrSB)进行酵母双杂交预实验,用以排除Fbxl16的毒性和自激活.之后按照酵母双杂交手册以pSosscirr1为诱饵质粒筛选大鼠脑cDNA文库pMyrcDNA.筛选与Fbxl16阳性相互作用的cDNA融合质粒,这些质粒将用于下一步的

7、回转验证.1.2.4回转验证阳性相互作用将筛选出的每个cDNA融合质粒分别与pSosscirr1共转化入酵母突变株进行回转验证.7在葡萄糖和半乳糖培养基上都不生长的克隆是假阳性相互作用克隆；在葡萄糖缺陷培养基上不生长而在半乳糖缺陷培养基上生长的克隆是真阳性相互作用克隆.之后从验证为真阳性的克隆中提取cDNA融合质粒，扩大培养后纯化、测序,从NCBI数据库中查出该cDNA对应的蛋白质.该蛋白就是能够与Fbxl16相互作用的蛋白质.2结果2.1融合蛋白表达质粒的构建引入NcoI和SalI酶切位点,将RTPCR得到的scirr1基因编码区片段克隆入

8、pSos空载体,构建出融合蛋白表达质粒pSosscirr1（图1）.M1:DNAmarkerDL15000;M2:DNAmarkerD