TGFβSmad信号蛋白在腹膜透析相关腹膜纤维化中作用机制的研究

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1、中山大学硕士学位论文TGF-β/Smad信号蛋白在腹膜透析相关腹膜纤维化中作用机制的研究姓名：段文娟申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：余学清2003.5.10TFG．13／Smad信号蛋白在腹膜透析相关腹膜纤维化中作用机制的碜堕主生奎兰堡主兰垡笙壅TGF．13／Smad信号蛋白在腹膜透析相关腹膜纤维化中作用机制的研究硕士研究生段文娟导师余学清教授中山大学附属第一医院肾内科中文摘要腹膜透析是临床上治疗急慢性肾功能衰竭-尿毒症病人的主要替代治疗方式之一，与另外两种治疗方式血液透析(HD)和肾移植相比，它操作简单、方便，不需复杂的仪器设备，

2、尤其适合广大农村和边远地区。腹膜透析对病人生活影响小，血流动力学稳定，对老年人尤其合并糖尿病、心血管疾病而不适进行血透的病人更为适合。在很长时期内(3-5年)腹透与血透病人死亡率无差异。至2000年底全球已有13万腹透病人，而这一数字仍在不断上升，腹透发展具有很大前景。近年来随着腹透连接系统的改进和腹膜炎发生率的下降，腹膜纤维化已是腹透病人退出腹透的主要原因，大大限制了腹透的发展。而反复发生腹膜炎和长期使用非生理相容性的腹透液是腹膜纤维化的两大主要原因。目前TGF．B已被公认在多个重要器官包括腹膜纤维化发生中起非常重要的作用。在糖尿病肾病中

3、，肾脏局部TGF．131浓度升高，常伴随明显的肾脏纤维化。在长期腹膜透析的病人中，病人腹透透出液中TGF．B1比正常人和刚开始腹透的病人升高，发生腹膜炎时增高程度更加明显。研究发现高糖及腹透病人的透出液能作用于腹膜问皮细胞使之分泌TGF-B1增多，后者又导致胶原等基质成分产生增多。以上证据都提示TGF．B1与腹膜纤维化关系密切。但TGF．B1在腹膜纤维化的发生和发展过程中是如何发挥作用的，其信号转导机制如何，尚不清楚。厂f近年来发现的Smads蛋白被证实是TGF-B家族介导的下游信号通道蛋白，～TGF—B的许多作用都是由这一通路而实现的。在

4、肾小球系膜细胞和肾小管上皮TFG一13／Smad信号蛋白在腹膜透析相关腹膜纤维化中作用机制的研究中山大学硕士学位论文细胞中发现有Smads蛋白的存在，参与了TGF-Bl诱导的细胞外基质的产生，可能在肾小球硬化纤维化中发挥重要作用。但在腹膜透析中，腹膜透析液中的高表达的TGF—B1是否能激活Smads蛋白，这～通路在腹膜纤维化发生中有何作＼o／、～．用?目前国内外尚无文献报道。)L厂本研究的目的就是观察TGF．13／Smad信号蛋白在腹膜间皮细胞的表达水平及其在腹膜纤维化中的作用。为此我们设计并完成了以下实验。1．TGF—B1对大鼠腹膜间皮细

5、胞(PMCs)Smad2、Smad7、Q．SNIA、ColI表达的影响，／目的探讨不同剂量的TGF—B1刺激大鼠腹膜间皮细胞不同时间对Smad2、Smad7、Ⅱ．SMA、ColI表达的影响及其相关关系。方法用酶消化法体外分离、培养、鉴定大鼠腹膜间皮细胞，分别用2．5，5，10ng／mlTGF-81刺激不同时间(5，lO，15，30，60，120min)，用细胞免疫化学方法观察p-Smad2在细胞中的定位和变化；Smad2、Smad7、a．SMA、CollagenI的基因表达用RT-PCR检测：Smad2和Smad7的蛋白表达用Western

6、blotting检测。结果体外培养的大鼠腹膜间皮细胞光镜下呈铺路石样，细胞免疫化学鉴定Cytokcratin阳性。外源性TGF．B1刺激大鼠腹膜问皮细胞后，磷酸化的Smad2迅速从胞浆向核中聚集，5min核内即有强烈的表达，30min后达到高峰，随后核内磷酸化的Smad2信号逐渐减弱，120min降至接近正常水平。RT-PCR和Westernblotting半定量检测发现，在外源性TGF-B1诱导下，大鼠腹膜问皮细胞Smad2、Smad7基因表达和蛋白表达增高，Smad2的表达5min即增高，高峰在30min，之后逐渐减弱至120min接近

7、正常水平。Smad7的表达迅速升高在5min时达到第一个高峰后下降，在30min重新升高直至120min，且比之第一个高峰表达水平更高。a．SMA、CollagenI的基因表达增高，呈浓度和时间依赖性。Smad2和a-SMA、CollagenI的表达之间呈现曲线相关。小结TGF一131能引起腹膜间皮细胞R-Smad的活化，导致腹膜间皮细胞表型改变，CollagenI基因表达增多，提示TGF．B1／Smad可能参与了腹膜纤维化的发生发展过程。l夕L一，IITFG．p／Smad信号蛋白在腹膜透析相关腹膜纤维化中作用机制的研究中山大学硕士学位论文

8、2．Smad7高度表达对TGF-B1诱导的问皮细胞(PMCs)Smad2、Q．SMA、ColI表达的影响，／目的观察基因转染高度表达的Smad7Yc寸TGF一131诱导的间皮细胞