下调WT1基因表达对人白血病细胞K562生物学行为及基因表达谱的影响

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1、山西医科大学博士学位论文摘要目的WTl(WilmsTllIIlorsuppressor-1)基因在各类白血病中异常高度表达，而且过度表达的WTl基因与正常细胞恶性转化有关。本实验拟通过I蝌A干扰(1酬Ainte哦rence，RNAi)技术，以WTl基因为靶点，构建编码人WTl基因的sllIⅢA(shorthai叩inl斟A)真核质粒表达载体，转染人白血病细胞K562，首先，观察其对K562细胞WTl基因mRNA及蛋白表达的抑制作用；其次，观察下调WTl基因表达对K562细胞形态、生长状况、细胞周期、增殖、凋亡及细胞分化等生物学行为的影响；再次

2、，探讨下调WTl基因表达对K562细胞基因表达谱的影响，为进一步研究WTl基因在白血病的生物学功能及白血病的基因治疗奠定基础。除此之外，我们还将探讨WTlstlIⅢA对耐药细胞株K562／A02对阿霉素药物敏感性的影响，揭示下调WTl基因表达逆转K562／A02细胞阿霉素耐药的可能作用。方法1．构建编码人WTl基因shRNA质粒表达载体根据s诹NA设计原则，设计合成WTlst瓜NA及无任何干扰效果的阴性stlI斟A的DNA模板单链，在两端加入限制性内切酶B觚1HI、HindIII的酶切位点，退火形成双链，质粒PGenesil．1的B锄HI+H

3、indIII双酶切线性化，稀释退火片段与线性化PGenesil．1质粒表达载体经T4DNA连接酶连接，酶切、测序鉴定。构建的三个重组质粒分别命名为pWTl-sm矾A1和pWTl-sl讧UNA2，pNeg。2．pWTl．sl汛NA转染K562细胞条件的优化不同比例质粒pWTl．shIⅢA和转染试剂Superfect的复合物，不同时间，转染K562细胞，因质粒中含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因，转染后可用荧光显微镜和流式细胞仪FITC的常规检测方法检测转染效率，根据转染效率，优化转染条件。3．pWTl．sllI悄A抑制K562细胞WTl

4、基因表达的研究用最佳配比的质粒pWTl．s11IⅢA1(或pWTl．s11IⅢA2)和转染试剂Supe疵ct的复合物转染K562细胞，分别于转染前及转染后48h，经流式细胞仪分选转染成功的细胞，实时荧光定量ImPCR检测WTlmI矾A表达水平，Westemblot法检测WTl相应功能蛋白的表达水平。同时设立未转染组、空质粒组(pcon)、阴性质粒(pNeg)组作为对照。4．下调WTl基因对K562细胞生物行为的影响pWTl．shRNA转染K562细胞后，倒置显微镜观察细胞生长状态，绘制细胞生长曲线；细胞涂片，Wri曲t．Giemsa染色，观察

5、细胞形态学改变；MTT检测细胞增殖抑制率；流式细胞仪Arulexill．V／PI试剂盒及DNA梯状条带电泳检测细胞凋亡情况，流式细胞术检测细胞周期的变化；转染后的细胞经1rI)A诱导，NBT还原试验及流式细胞分析细胞分化抗原CD9、CDl4判断pWTl．sllI斟A对TPA诱导K562细胞分化的影响，同时设立同时设立未转染组、空质粒组(pcon)、阴性质粒(pNeg)组作为对照。山西医科大学博士学位论文5．下调WTl基因表达K562／A02细胞对阿霉素敏感性的影响pWTlsllIⅢAl转染K562／A02细胞48h，流式细胞术(FCM)检测转

6、染效率，经阿霉素作用后，MTT检测细胞阿霉素IC50的变化；FCM检测细胞阿霉素累积量，及细胞凋亡的变化，同时设立未转染组、空质粒组(pCon)、阴性质粒(pNeg)组作为对照。6．下调WTl基因表达对K562细胞基因表达谱的影响转染组流式细胞分选EGFP阳性的细胞，纯化后，逆转录为cDNA，转染组与对照组分别用cy3、cy5标记，与22KhumaIlgenomean．ay基因芯片杂交，经Lu)【Sc趾lOKA双通道激光扫描仪扫描，LuXSc锄3．0图像分析软件分析，观察杂交效果；聚类分析评价三次实验的一致性；所得信息进行差异表达基因的筛选，

7、并进一步行path、vay及GO基因功能分类等生物信息学分析。选择分析结果中上调和下调基因各一个，进行荧光定量RT-PCR验证。本部分为三次生物学重复结果1．构建编码人WTl基因st瓜NA质粒表达载体经酶切、测序鉴定pWTlsl煅NAl，pWTlsmⅢA2，pNeg构建成功。2．转染条件的优化不同比例质粒与转染试剂复合物转染K562(2×106／m1)细胞，当质粒DNA为1．5嵋，DNA：SF为1：4，转染48h，转染效率达到峰值(65．34士5．64)％，与对照组相比差异具有显著性(萨O．05)。3．pWTls}lI斟A对K562细胞WTl

8、基因表达的抑制作用转染48h流式细胞仪分选EGFP阳性的细胞，纯度可达98．0％士1．2％，荧光定量RT_PCR及Westem-b10t结果显示：pWTl．shIⅢ