用环介导等温扩增方法检测牛奶中致病微生物

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1、检验检测*用环介导等温扩增方法检测牛奶中致病微生物苑学霞1张树秋1冯静2谷晓红1王文博1刘磊3李行2李瑞菊1（1.山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，山东省食品质量与安全检测技术重点实验室，山东省农业科学院－北卡罗莱纳州立大学农产品检测技术和风险评估联合实验室，济南250100；2.北京勤邦生物技术有限公司，北京102206；3.北京良润生物科技有限公司，北京102200）摘要：环介导等温扩增技术（LAMP）是一种新型的基因扩增方法。本试验以牛奶为研究对象，采用LAMP方法检测其中沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠

2、埃希氏菌O157、志贺氏菌和单增李斯特菌，并与国标方法进行比较。结果表明，LAMP方法和国家标准方法检测结果一致，结果符合率为100％，重复性好，灵敏度≤2CFU/25g，特异性高。LAMP方法可广泛应用于牛奶中致病菌的快速检测。关键词：牛奶；环介导等温扩增（LAMP）；致病菌；快速检测食源性致病菌是危害食品安全和人类健康的主因扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。自发明以要因素。我国2014年食物中毒事件报告中，微生来，被迅速应用于病原微生物[4～5][6]快速、食品安全物性食物中毒事件次数和中毒人数最多，分别占食检测等领域，具有广阔的

3、应用前景。物中毒事件总次数和中毒总人数的42.5％和本文以牛奶为原料，利用LAMP技术分析其67.7％，且均为由沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄中沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、大色葡萄球菌及其肠毒素、大肠埃希氏菌、志贺氏菌肠埃希氏菌O157、志贺氏菌和单增李斯特菌，并等引起的细菌性食物中毒事件[1]。牛奶质量安全直与国家标准方法进行比较，旨在为牛奶中致病菌的接影响到我国奶业的健康发展，成为新时期我国奶监测提供一种快速、准确的检测手段，为牛奶行业业发展的新瓶颈[2]。因此，加强牛奶中致病菌的检测的健康发展提供技术支持。对优质乳制品

4、生产非常重要。目前对牛奶中致病菌的监测主要是按照国家标一、材料与方法准的方法进行，此方法经典可靠，无特殊设备要求，但检测周期长，费时费力。环介导等温扩增（一）材料（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）1.试验样品：牛奶取自山东省济南市某奶牛养技术是2000年由日本研究人员Notomi等[3]发明的殖厂。一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术，其2.试验菌株：沙门氏菌CMCC（B）20071、运用一套2对可以识别目的基因序列的6个特定区副溶血性弧菌ATCC17802、金黄色葡萄球菌域引物

5、，在恒定温度条件下（60℃～80℃）进行基ATCC25923、大肠埃希氏菌O157:H7ATCC43894、*基金项目：山东省自主创新及成果转化专项经费资助（2014ZZCX02703），公益性行业（农业）科研专项经费资助（201403071），山东省农业科学院青年科研基金项目（2014QNM57）。作者简介：苑学霞（1980－），副研究员，从事农产品质量安全与检测技术研究。E－mail：yuanxuexia@sohu.com。王文博（1974－），副研究员，从事农产品质量安全与检测技术研究。E－mail：wangwb74@163.c

6、om（通讯作者）。农产品质量与安全2015年第5期41检验检测志贺氏菌CMCC51175和单增李斯特菌ATCC的结果。54002，北京勤邦生物技术有限公司提供。副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏3.培养基：检测沙门氏菌、副溶血性弧菌、金菌O157、志贺氏菌、单增李斯特菌的检测分别采黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157、志贺氏菌和用对应的核酸LAMP检测试剂盒和国家标准，其单增李斯特菌所需培养基，均购自广东环凯微生物他试验方法同上。科技有限公司。4.特异性试验。取牛奶样品6份，分别加入培4.试剂盒：沙门氏菌核酸LAMP检测试剂盒、养

7、的沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌核酸LAMP检测试剂盒、金黄色葡大肠埃希氏菌O157、志贺氏菌、单增李斯特菌悬萄球菌核酸LAMP检测试剂盒、大肠埃希氏菌液，混匀后取样增菌，每个样品用6种核酸LAMPO157核酸LAMP检测试剂盒、志贺氏菌核酸检测试剂盒进行检测。LAMP检测试剂盒、单增李斯特菌核酸LAMP检测试剂盒，北京勤邦生物技术有限公司提供。二、结果与分析5.仪器与设备：生化培养箱，购自上海新苗医疗器械制造有限公司。拍击式均质器，西班牙IUL公（一）准确度试验对于牛奶中6种致病菌，司。灭菌器，山东省新华医疗器

8、械股份有限公司。核酸LAMP方法和国家标准方法检测结果一致，（二）方法阳性结果和阴性结果符合率为100％（见表1）。1.准确度试验。取牛奶样品20份，随机加入培养的沙门氏菌悬液4～6份，混匀后取样，增菌表1核酸LAMP方