环介导等温扩增技术在转基因成分筛选检测方法中的研究

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1、上海交通大学硕士学位论文环介导等温扩增技术在转基因成分筛选检测方法中的研究硕士生：王丛导师：杨立桃专业：生物学上海交通大学生命科学技术学院2015年5月万方数据ResearchandDevelopmentofscreeningLAMPassaysforGMOanalysisAuthor:CongWangAdvisor:LitaoYangSpecialty:BiologySchoolofLifeScienceandBiotechnologyShanghaiJiaoTongUniversityShanghai,P.R.ChinaMay,

2、2015万方数据万方数据万方数据万方数据上海交通大学硕士学位论文环介导等温扩增技术在转基因成分筛选检测方法中的研究摘要随着基因工程与分子生物技术的快速发展，转基因生物的研发和商业化日益增多。与此同时，公众对转基因产品的安全性仍存忧虑。因此，转基因生物的产业化过程中，转基因成分检测作为其中重要的技术支撑，对于转基因生物的监管尤为重要。同时，转基因生物中的插入基因和基因修饰越来越复杂和多样化，商业化的转基因作物数量也呈现出逐年递增的趋势，转基因成分的检测方法逐渐向对针对多靶标进行的快速、精准、高通量的核酸检测分析技术方向发展。聚合酶链式

3、反应（PCR）技术及实时荧光定量PCR技术已成为转基因产品常规的定性、定量检测方法，但这些技术都需要对温度循环高精度控制的专业仪器，并且检测时间都比较长，这样就极大限制了这些方法在快速检测、田间实验的推广应用。与此同时，核酸恒温扩增技术得到了不断发展与更新，其中，环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）是一种不需要精密仪器和繁琐操作步骤I万方数据上海交通大学硕士学位论文的等温扩增方法，此技术具有高特异性，高灵敏度以及快速的特点，也因此在转基因成分检测方面得到了广泛关注。

4、本研究侧重转基因成分快速筛选，根据八个常见转基因元件（CaMV35S启动子，FMV35S启动子，bar，cry1Ac，CP4epsps，pat，NptII和NOS终止子）的序列信息，设计特异性环介导等温扩增引物，优化LAMP反应体系，并通过在环介导等温扩增反应产物中加入SYBRGreenI（1000×）荧光染料，建立了可视化的环介导等温扩增转基因筛选体系。实验结果证明建立的八种转基因元件特异性环介导等温扩增检测方法具有高特异性，并且灵敏度（检测限LOD）全部达到10个拷贝的基因组DNA，与传统定性PCR的检测限相比，从整体上有了一定

5、幅度的提高[81]，并且整个检测过程所需要的时间仅为一个小时，通过肉眼观察颜色的变化即可立即判断出检测结果，不再需要扩增后的电泳检测。此外，对于来自上海出入境检验检疫局的实际样品，我们利用LAMP检测的结果也与理论结果完全一致。所以环介导等温扩增技术为实现快速，便捷的田间检测提供了完全有力的技术支撑。关键词：环介导等温扩增技术，转基因检测，筛选，转基因元件II万方数据上海交通大学硕士学位论文RESEARCHANDDEVELOPMENTOFSCREENINGLAMPASSAYSFORGMOANALYSISABSTRACTWiththe

6、rapiddevelopmentofgeneticengineeringandmolecularbiologytechniques,largenumberofGMproductshavebeencommercializedandappearedinthemarket.Meanwhile,peoplestillworryaboutthesafetyissuesaboutGMproducts；theinsertedgenesandgeneticmodificationisbecomingmoreandmorecomplexwiththe

7、numberofcommercializedGMcropsincreasing,sotheanalyticalapproachesbeingfaster,accurateandallowingforhigh-throughputwillbethefuturetrend.AlthoughPCRtechnologyandreal-timePCRtechniquehasbeenusedinroutinelabanalysisforGMOs,thesetwotechniqueshighlydependedonhigh-precisionin

8、strumentsandtediousexperimentalsteps,whichlimitedtheirapplicationonspotfieldtestgreatly.Loop-mediatedisothermalamplif