NFκB在实验性暴发性肝衰竭肝细胞凋亡中的作用及其机制

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2、文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研触繇何d9i扒聊躲彤9擘年；月矿日中文摘要NF．KB在实验性暴发性肝衰竭肝细胞凋亡中的作用及其机制摘要目的：暴发性肝衰竭(fulminanthepaticfailure，FHF)是由多种原因引起的大量肝细胞坏死而出现严重的肝功能障碍，病人短期内进展至肝性脑病的一种综合征【1】。具有起病急、进展快、病死率高的特点，迄今仍无有效治疗措施。虽然近年来

3、在暴发性肝衰竭的发病机制、临床诊断、治疗等方面的研究取得了较大进展，但其发病机制仍不甚明确。发病机制的研究是提高FHF的防治水平的关键。目前研究认为，FHF发生大块肝细胞坏死的病理过程中，细胞凋亡起着重要的作用【∞。细胞凋亡的发生受凋亡相关基因的调控。凋亡调控基因可分为诱导基因和抑制基因。正常情况下两者表达平衡，若因某些因素刺激使其失衡，则导致疾病发生。Survivin是目前已知的抗凋亡作用最强的凋亡抑制蛋白【41。C．myc是诱导细胞凋亡的重要因素【371。核转录因子(nuclearfactorofkappaB，NF．r,

4、B)是一种广泛存在于细胞中的具有多向性调节作用的转录因子，可启动许多与细胞凋亡调控有关的基因的转录【5】，如凋亡蛋白酶(caspase)、Bcl．2蛋白家族、死亡受体、凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotein，IAP)和某些原癌基因等【6】。在肝脏炎症、纤维化、肝细胞凋亡与再生等病理生理过程中均伴有NF．r,B的活化，是调控肝脏病理损害的重要转录因子。但是由于刺激NF—r,B活化的因素不同，活化的靶基因不中文摘要同，NF．KB在调控细胞凋亡方面也发挥着不同的作用，通过信号转导途径既可抑制肝细胞的凋

5、亡亦可促进肝细胞的凋亡。但目前国内外研究多集中在肝脏肿瘤方面，对其在暴发性肝衰竭肝细胞凋亡的作用研究较少，其机制尚不清楚。为此，本研究采用免疫组织化学和Westernblotting方法检测暴发性肝衰竭大鼠肝组织NF．KB、survivin和c．myc的表达情况，通过形态学和流式细胞学观察肝细胞凋亡情况，分析NF．r．B活性与肝细胞凋亡程度、凋亡抑制蛋白survivin、原癌基因c．myc的关系，从细胞和蛋白水平探讨NF．r．B在暴发性肝衰竭肝细胞凋亡中的作用及作用机制。为临床如何应用NF．r．B抑制剂治疗暴发性肝衰竭提供理

6、论依据。方法：1．研究对象：雄性Wistar大鼠45只，清洁级，体重180～2009。将大鼠随机分为模型组30只，对照组15只。模型组腹腔注射D．氨基半乳糖(D．galactosamine，D．GaIN)800mg／kg，．之后皮内注射脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)10I．tg／kg，制造暴发性肝衰竭模型。对照组注射同样体积的生理盐水。2．标本的采集和保存：分别于注药后2、4、8、12、24小时行股静脉放血处死，各时间点取模型组6只，对照组3只大鼠放血处死后立即剖腹取出肝脏，取适量肝组织分别经10％

7、中性甲醛溶液、70％乙醇及4％戊二醛固定，部分经液氮速冻后置．80℃冰箱保存备用。3．光镜及电镜下观察肝组织病理学改变。4．采用免疫组化S—P法，对肝组织标本进行NF．r．Bp65、survivin和c．myc的免疫组化染色。结果评估参照Fromowitz01的综合计分法进行。分别按染色细胞的分布和染色深度计分，最终结果用阴性、弱阳性、阳性、强阳性来表示。5．Westernblotting检测中文摘要细胞核内NF．r,B蛋白和总蛋白内survivin蛋白的表达。6．流式细胞术进行细胞凋亡率定量检测和细胞周期分析。7．统计学处

8、理：应用SPSS13．0统计软件进行统计学分析，采用秩和检验和Spearman秩相关分析。P<0。01时有显著性差异。结果：1．一般状况观察：对照组大鼠一般状况较好，无死亡。模型组随着给药时间延长，大鼠依次出现活动减少、精神萎靡、毛发竖立、反应迟钝、嗜睡、昏迷。2．肝组织形态学观察：(1)