survivin在微囊化肝细胞移植治疗暴发性肝衰竭大鼠肝组织中动态变化

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1、温州医学院硕士学位论文survivin在微囊化肝细胞移植治疗暴发性肝衰竭大鼠肝组织中的动态变化姓名：高峰申请学位级别：硕士专业：内科学（传染病学）指导教师：陈永平;李骥20070501墨州医学院硕士学位论文缩略词表沮州医学院硕士学位论文Survivin在微囊化肝细胞移植治疗暴发性肝衰竭大鼠肝组织中的动态变化研究生：高峰导师：陈永平中文摘要背景和目的暴发性肝衰竭(fulminanthepaticfailure,FHF)是严重危害着人体健康的肝脏疾病，虽然肝移植术已明显改善了FHF的预后，但是由于健康供肝短缺及

2、昂贵的价格，难以满足临床需要。生物型人工肝与肝细胞移植是近年肝衰竭治疗的研究热点，但免疫排斥是其发展瓶颈，近几年发展起来的微囊化肝细胞具有有效的免疫隔离屏障，在细胞移植中的研究正受到越来越多的关注。另外，残存肝细胞能否及时有效再生并完全或部分发挥其功能也是FHF患者能否存活的关键，是多因素、多环节的病理生理过程。近期survivin在细胞凋亡和再生调控的分子机制中的一些重要发现使其成为研究热点，有可能成为药物及基因治疗的可能靶点之一。本实验将分离的正常大鼠肝细胞微囊化，移植到暴发性肝衰竭大鼠腹腔内，通过观察

3、大鼠肝功能和肝组织中survivin的变化等，探讨微囊化肝细胞腹腔移植对FHF大鼠肝再生方面的影响。方法1．微囊化大鼠肝细胞的制备用Seglen改良二步胰酶灌注法对健康大鼠肝脏进行肝细胞分离及纯化，所得肝细胞悬液在血细胞计数板上作细胞计数，用O．4％台盼蓝染色判断细胞产量及活率。获取的肝细胞在含有多种辅助因子的RPl640混合培养基中与2．O％海藻酸钠等材料混匀，在自制装置下制备微囊化肝细胞并观察形态学特征。2．将雄性成年SD大鼠腹腔注射D．氨基半乳糖(D．GAIN)制备FHF模型，对照组注射同等体积的生理

4、盐水。将FHF模型大鼠在造模后18h随机分成3组：I组为培养液组：I／组为裸肝细胞移植组，腹腔内植入游离同种异体肝细胞；III组为微囊化肝细胞移植组，大鼠腹腔内植入微囊化同种异体肝细胞。3．分别在造模后的24h、36h、48h、72h、120h、148h、240h动态观察血清肝功2温州医学院硕士学位论文能生化指标丙氨酸氨基转移酶(ALl’)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBil)的变化，留取肝组织用免疫组织化学方法(SABC法)检测survivin蛋白的表达，每次以已知sufvivin阳性肝细

5、胞癌切片作为阳性对照，PBS代替第一抗体作为阴性对照，每张切片随机选取5．10个高倍镜视野(×400)，计算每1000个肝细胞中survivin阳性细胞数，为survivin标记指数(survivinlabelingindex，survivin-L1)，gllsurvivin-LI=survivin阳性细胞数／1000x100％。另每组随机留取15只用来观察存活率。4．用半定量逆转录一聚合酶链反应(RT—PcR)方法检测survivinmRNA的表达。三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPD田作为内参对照，100bp、

6、250bp标准碱基确定PCR产物大小，1．5％琼脂糖凝胶电泳后拍照，置凝胶电泳处理系统成像，TolallabVIOl软件半定量分析survivirdGAPDH灰度比值。5．取6只正常大鼠的血清及肝组织检测以上指标作为正常对照。结果1．每只大鼠分离纯化后所得肝细胞经0．4％台盼蓝染色判断细胞产量为(8．45-．L-0．97)x107，活率为91．83i：2．48％。2．获取的肝细胞在含有多种辅助因子的RPl640培养基中与2．O％海藻酸钠等材料混匀，在自制装置下制备微囊化肝细胞，经0．4％台盼蓝染色后85％以

7、上肝细胞成活，微囊大小在400pm．800pm之间。3．模型建立后24h，大鼠表现极度虚弱、活动明显减少、食欲明显减退、口腔有出血、精神萎靡、嗜睡、抽搐、昏迷等；血ALT、AST和TBil明显升高：肝病理学表现为肝细胞坏死广泛而严重，出现弥漫性的大片坏死，细胞溶解，肝索解离，小叶结构模糊不清，失去正常的肝组织结构，肝窦明显扩张并出血，小叶内及汇管区有淋巴细胞和巨噬细胞为主的炎症细胞浸润，残存肝细胞水肿变性，这表明FHF动物模型成功建立。4．肝功能衰竭模型建立后ALT、AST、TBil迅速升高(P

8、，并于48h达高峰。同一时间点两两比较发现，II、III组在48h、72h、12011、168h均明显低于I组(P