EBV-LMP2A基因慢病毒载体质粒的构建及体外表达、鉴定

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1、Ir-——-—’——_——--———_———_————————-—————_-——————-—_—_-———_—_—————————_-——_——_————_—_—-_'————————型竖鳖坠鲨墼———一YII-117I■■114r，■^，■■■i15l14IIIoir1II■目录●●一、中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3二、英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5三、正文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8第一部分材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1O结果⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20第二部分材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22妒结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。■⋯．32分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41第三部分材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42月I果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53泸结’、分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯58，J、结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯60参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6o附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯63致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯64·四、综述及参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．65-36●温州医学院硕t=学位论文英文缩写英文全称AmpArc．心BCRbpcDNACTLDEPCDMEMDMSOEBEBVEDTAELISAFBSFITCGFPHDHⅣHRPI礤LCLLMP2MHCmRNA缩略词表AmpicillinAcrylamideAmmomumpersulfateBcellrceptorBasepairComplementarydeoxyribonucleicacidCytotoxicTlymphocyte

4、sDiethypyrocarbonateDulbecco’SmodifiedEagle’SMediumdimethylsulfoxideEthidiumbromideEpstein—BarrVirusEthyleneDiamininetetraceticacidEnzyme—linkedimmunosorbentassayFetalbovineserumFluoresceinisothiocyanateGreenfluorescentproteinHodgkin’sdiseaseHumanimmunodeficiencyvirusHorSeradishp

5、eroxidaseIndirectimmunofluorescencelymphoblastoidcelllineLatentmembraneprotein2MajorhistocompatibilitycomplexMessengerribonucleicacid中文全称氨节青霉素丙烯酰胺过硫酸铵B细胞受体碱基对互补脱氧核糖核酸细胞毒性T淋巴细胞焦碳酸二乙酯DMEM培养基二甲亚枫溴化乙啶_EB病毒乙二胺四乙酸酶联免疫吸附试验胎牛血清异硫氰酸荧光素绿色荧光蛋白霍奇金病人免疫缺陷病毒辣根过氧化物酶间接免疫荧光淋巴母细胞样细胞系潜伏膜蛋白2主要组织相容性复合

6、体信使RNA■●’9NPCODPBSPCRPIRNAIrT-PCRSDS—PAGETEMED2温州医学院顾L学位论文中文摘要1．目的：1．从B95-8细胞中获得EB病毒潜伏膜蛋白2A(EBV—LMP2A)全长编码区基因序列。2．EBV-LMP2AN端1-119位氨基酸(EBV—LMP2AH。。)的基因克隆及其原核蛋白表达与纯化：构建含EBV—LMP2A。．u。的原核重组质粒PGEX／EBV—LMP2AHm经IPTG诱导后用WesternBlot进行特异性鉴定。采用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化融合蛋白EBV-LMP2A，．n。，进行动物免疫制备小鼠免疫血

7、清，用于下续研究。3．EBV-LMP2A基因重组慢病毒载体的构建及体外表达鉴定：构建慢病毒重组质粒CFUGW／EBV—LMP2A／EGFP和CFUGW／EBV—LMP2A，转染COS-7细胞，经RT-PCR、直接荧光(间接免疫荧光)、WesternBlot分析证实EBV-LMP2A目的蛋白的表达。方法：1．提取EBV标准株(B95-8细胞)总RNA，通过逆转录获得cDNA，并设计特异性引物，扩增获得EBV-LMP2A全长基因。2．将获得的EBV—LMP2A。州。基因序列插入原核表达载体PGEX-4T-1，并在EBV—LMP2A。．¨，基因序列末端加上6X

8、His标签以便于纯化，构建含有His标签的重组质粒PGEX／EBV—LMP2AH