渗透胁迫下白花柽柳SSH文库构建及质膜水孔蛋白基因克隆

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1、摘要地球上约三分之一土地属于干旱区或半干旱区，在这些地方，缺水已成为制约农林业发展的瓶颈，严重影响人类的生存和发展。深入研究生长在干旱地区的植物的抗旱机理，克隆与抗旱相关的基因，对于大幅度提高干旱地区的生产潜力有重要的战略意义。本研究正是以此为目的，将新疆白花柽柳用终浓度25％(W，v)的聚乙二醇6000进行胁迫处理，取其小枝为试材，利用抑制性消减技术(ssm构建cDNA文库，分析在渗透胁迫下，基因表达情况。根据文库信息，用RACE技术克隆与抗旱相关的全长基因，探讨白花柽柳的抗渗透胁迫分子机理，为抗旱分子育种工作奠定理论和物质基础。随机挑取sSH文库的288个阳性克隆进

2、行测序，共获得207条有效的序列，已登录GenBallk，登录号为EBl87088一EBl87295。对98个UniqueEST序列进行BlasⅨ分析，有79个EST与己知功能的基因序列相似，19个与未知功能的基因相似。对该文库进行GO分类，使我们从不同角度理解98个uhique序列在细胞组件、分子功能和生物学途径中的作用。根据这些EST所代表的基因的生理生化作用，按功能将其分为10类。其中有52个基因与渗透胁迫关系密切，对它们进行了分析讨论。柽柳的抗渗透胁迫过程涉及信号转导与基因的表达调控、渗透胁迫物质的合成、防御反应、转运作用与离子平衡、活性氧清除、救援、防御蛋白合

3、成、修复和保护光合系统等多种途径的综合作用。获得与抗渗透胁迫密切相关的G蛋白类fEBl87186、EBl87233、EBl871261、钙网蛋白(EBl87218)、丝氨酸／苏氨酸激酶(EBl87235)、钙结合EF家族蛋白(EBl87165)、钙依赖蛋白激酶(EBl87146)、腺苷酸环化酶关联蛋白(EBl87203)、MAP3Ka(EBl87182)、海藻糖．6．磷酸合酶(EBl87156)、脱水素DHN6(EBl87153)、n一甘露糖苷酶(EBl87148)、脂质转运蛋白(EBl87132)、质膜水通道蛋白(EBl87092)、过氧化氢酶(EBl87294)、e

4、IFl(EBl87220)、翻译起始因子相似蛋白(EBl87205)、sKPl蛋白(EBl87159)、苹果酸脱氢酶(EBl87089)、类亮氨酸拉链蛋白(EBl87102)、类锌指蛋白(EBl87252)等重要基因的遗传信息。利用E∽CE技术从渗透胁迫处理的白花柽柳的小枝中克隆一个全长质膜水孔蛋白基因，该基因包含1043bp核菅酸序列，其中70bp前导序列，864bp的开放阅读框及109bp的3’非编码区，编码287个氨基酸，分子量约30．9KD，命名为TnQP，GenBank登录号DQ66089l。TaAOP具有MIP基因家族序列的信号序列HINPAVTFG，并且含

5、有高等植物质膜水孔蛋白的特征序列GGGANXxXXGY和TGI／TNPARSL／FGAAI／VI，VF／vN；经预测具有6个跨膜区，其氮基酸残基与MIP蛋白保守区序列100％一致，预测该蛋东北林业大学博士学位论文白的氨基酸序列理论等电点为8．84，不稳定系数36．67，为稳定蛋白。其平均亲水性值为O-377，该转运蛋白符合膜蛋白的特征，具有很强的疏水性。核苷酸序列与拟南芥的n口．c(NP567178)，同源性达到95％，得分值530，E值5e．149。白花柽柳是新疆特有种，迄今为止，以它为试材，进行渗透胁迫处理，构建抑制性消减杂交文库未见报导。白花柽柳的质膜水孔蛋白的克

6、隆和分析尚属首次。关键词白花柽柳：渗透胁迫；抑制性消减杂交文库：基因克隆：水孔蛋白AbstractRai】[1lessregionandscnliaridrc西onacco衄tforonemirdofthcearthl卸dsurf如earc孔Inthcse缸eas，lackofwaterh勰beenabottleneckthatresmctsthcdcvel叩mclltofagricult【lrea11dforestry，hasas仃DngimpactonmelivingafIddeveiopmentofhu蚴．Illustratingt}lcdmught—resist

7、antmechanjsmofmeplantsgrownintlleseare船、城llbebeneficialt0improving血eproductionpotemialof也eseareas．Withmis缸，asuppressionsubtractiVehybridizationlibm】呵of劢脚卯拓翻6胡。肛“坍、vascon啦uctedusingtheosmosistreatcdleaves，andtheexpressionpa牡emofoSmoticrelatedgenewaSa11alyzed．Furthennore，th