激活蛋白诱导的水稻叶片SSH文库的构建

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1、分类号UDCY932325密级单位代码湖南农业大学硕士学位论文激活蛋白诱导的水稻叶片ssH文库的构建CodstmctionofanSSHLibfary矗姗0，y职j口ffv盘Leaves1nducedbyAdiVatorProteiIl提交论文日期答辩委员会主席学位授予日期研究生姓名指导教师学科专业研究方向一堑复型丝副数援堡焦塞婴塞旦擅物遁堡堂生堑陵监塑§生』旦论文答辩日期童9磊翻兢虽论文评阅人二00六年五月刀彤．6．2激活蛋白诱导的水稻叶片SSH文库的构建摘要植物激活蛋白是一类从多种植物病原真

2、菌中分离得到的新型蛋白质，激活蛋白的核酸和氨基酸序列完全不同于已知的Harpin蛋白和Elicitin蛋白，与数据库中的已知蛋白均无同源性。它通过激活植物体内一系列相关基因，使植株表现出良好的抗病防虫、增强抗逆能力、促进植物生长等生物活性，且性能稳定、易分解、无残留；作为一种新型蛋白质农药，激活蛋白具有广阔的应用前景。为了进一步了解激活蛋白的作用机制，本研究构建了激活蛋白诱导的水稻叶片差异表达基因文库，并对部分基因进行了分析。抑制性差减杂交(suppressionsubtractiveHybri

3、dization，ssH)是一种分离差异表达基因的技术。该技术以差减杂交和抑制性PcR为基础，可快速有效地分离出差异表达基因，假阳性率低，效率较高，广泛用于生：：勿及医学领域差异基因的克隆。本研究采用从稻瘟菌(舱卵a阳r抽eg—Psea)中分离纯化出的激活蛋白，利用SSH技术，以激活蛋白处理的水稻作为处理组(tester)，空白对照作为对照组(driver)，构建水稻幼苗的正向差异表达cDNA文库。共获得1756个克隆，将其中267个阳性克隆送出测序，最终得到204条序列。利用BLAsT在Gen

4、Bank数据库中对获得的cDNA序列进行相似性比对分析，除去重复序列后，共得到28个上升表达差异基因。这些基因所编码的蛋白质中有18个为功能已知或推测蛋白，这些基因涉及植物体内各种代谢反应，其中有4个基因参与了叶绿体的形成；3个参与了营养物质的转运代谢；其他的参与诸如细胞的周期调控、胞内细胞器运动、信号传导、基因调控、防卫反应等多种植物的生理生化功能。有lO个基因在数据库中找到同源性序列，但功能尚不清楚；本研究为揭示激活蛋白的作用机理奠定基础。关键词：植物激活蛋白、抑制差减杂交(ssH)、差异表

5、达基因1999，2(1)：56—61．16．闻伟刚，王金生．水稻白叶枯病菌Harpin基因的克隆与表达【J】．植物病理学报，2001，31(4)：295—300．17．WeiZM，LabyRJ，ZuⅡ10ffCH，eta1．Harpin，elicitorofthehypersensitiveresponsepmducedbymeplaIltpatllogen西wi，l妇日，础fov。rⅡ【J】．scicnce，1992，257(5066)：85．88．18．刘爱新，Hafpinx。。诱发植物过敏

6、反应和抗病性信号传导解析．山东农业大学博士学位论文，2003．19．姚桢．Harpin促进植物生长和诱导抗早的信号传导解析以及作用定位的初步研究．南京农业大学硕士学位论文，2004．20．郭晓静．水稻细条斑病菌Harpinx。蛋白功能域研究．南京农业大学硕士学位论文，2004．21．梁元存，刘爱新，董汉松．Elicmns与植物的抗病性【J】微生物学通报，2004，31(2)：134一137．22．蒋冬花，郭泽建．激发素(elicitins)研究进展【J】．农业生物技术学报，2004，12(3)：

7、338—344．23．K锄ounS，YOungM，GlascockCB，cta1．Ex廿acellularproteinelicitonsfmm聊托Ip^确orn：host—specificityandinductionofresistaIlcetobacterial趾dfllngalphytopamogens【J】．MolPlant-MicmbeInteract，1993，6：15．第一章文献综述新型微生物蛋白农药能诱导植物体内处于蛰伏状态的一些基因进行表达，从而使植物的性状与未经诱导的植株发

8、生显著差别，保护植物免受害虫和病原物的进一步侵害。植物本身所包含的基因信息足够抵抗害虫和病原菌的侵害，但这些基因在末施用新型微生物蛋白农药时却不能得到表达，或表达量很低，新型微生物蛋白农药的作用就是激发这些基因的表达。因此，对这些由新型微生物蛋白农药诱导的差异表达基因进行研究，可以使我们对植物抵抗害虫和病原物的作用机制有更加清晰的了解。基因的差异表达是普遍存在的，它存在于所有的生命进程，生物体在不同发育阶段、不同生理状态以及不同类型的细胞中，基因的表达不尽相同⋯。它决定了生命的多样性和复杂性。对