柽柳、星星草金属硫蛋白基因克隆及生物学功能研究

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1、摘要我国土壤重金属污染问题不断恶化，亟待解决。深入研究植物的耐重金属机理，克隆相关基因并利用基因工程技术提高植物对重金属的抗性，是净化污染土壤的一条有效途径。金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类广泛存在于生物中的低分子量，富含半胱氨酸可结合重金属的蛋白质，在土壤重金属污染的治理中越来越引起人们的重视。应用生物信息学技术从柽柳和星星草cDNA文库中分别克隆了柽柳和星星草的MT基因，对该基因编码的MT进行了蛋白质家族、疏水性、信号肽、等电点及分子量的预测，并选取了几种植物的MT基因氨基酸序列进行了多序列比对分析及分子进化树绘制，结果表明克隆的柽柳和星

2、星草MT基因符合植物MT基因所具有的典型特征。将从柽柳中克隆到的^仃基因构建到载体pROKII上，通过农杆菌介导的叶盘法对烟草进行遗传转化，共获得75株卡那霉素抗性苗，转化率达到78％。选取10株长势良好的转基因烟草进行分析，PCR检测结果均为阳性：对其中价转基因株系进行PCR-,Southern杂交和Northern杂交，结果均为阳性，证明外源基因已整合到烟草基因组中并得到表达。将在柽柳和星星草中克隆到的MT基因分别连接到载体pRoKn上，构建了柽柳和星星草MT基因双价植物表达载体，对烟草进行遗传转化，共获得83株卡那霉素抗性苗，转化率达到75％。选取10株长势良

3、好的转基因烟草进行分析，PCR检测结果均为阳性；对其中7个转基因株系分别用柽柳和星星草MT基因标记的探针进行PCR-Southern杂交，结果均为阳性；再从中选取5个转基因株系进行Northern杂交，结果均为阳性，证明外源基因已整合到烟草基因组中并得到表达。对非转基因对照烟草、转柽柳MT基因烟草和转柽柳、星星草MT基因烟草To代组培苗进行了重金属CA和Cu胁迫试验，测定并分析了各转基因烟草及非转基因对照烟草胁迫后的生根率、增重和株高变化。结果显示，T0代转基因烟草在不同浓度CdCl2和CuS04胁迫条件下，生根率、增重和株高均高于非转基因对照烟草。在CdCl2胁迫

4、下，非转基因对照烟草能在100Ⅳmol·L-1CdCl2浓度下生长，转柽柳MT基因烟草能在200口mol·L-1CdCl2浓度下生长，而转柽柳、星星草Mr基因烟草能在300／Ymol·L-1CdCl2浓度下生长。在CuS04胁迫下，在75／％mol-L．1CuS04浓度下，三者均能正常生长：在150pmol·L1CuS04浓度下，对照烟草不能生长，转柽柳MT基因烟草生长缓慢，植株矮小，转柽柳、星星草MT基因烟草大部分能正常生长；在225pmol·L-1CuS04浓度下，转柽柳、星星草MT基因烟草不能生长，但生长量有所增加。试验表明，肘r基因的导入提高了T0代转基因烟

5、草对CA和Cu的耐受力，其中转基因烟草对Cd的抗性要高于对Cu的抗性，并且转双价MT基因比转单价bit基因更能提高转基因烟草对重金属的耐受力。东北林业人学博E学位论文将T0代自交得到的转基因烟草种子播种于含100mg·L_1Kan的MS培养基上培养20d后，对8个转基因株系的绿白苗之比进行统计，结果表明转柽柳M瑾因烟草Tl-5、T1．8和转柽柳、星星草臌因烟草Tl’．2、T1’．3的绿色苗与白化苗分离规律基本符合<22．1)：1；转柽柳腱因烟草I"1．6和转柽柳、星星草^盯基因烟草1"1’．9株系的绿色苗与白化苗分离规律基本符合(24．1)：1。对8个转基因株系卡那

6、霉素抗性植株进行PCR检测，结果均为阳性，初步证明了MT基因仍整合在烟草子一代基因组中。对8个转基因烟草株系子一代(T1)进行了CA胁迫试验，测定并分析了CdCl2胁迫下转基因烟草生长量的变化。结果显示，转基因烟草T1代组培苗在根长、根数、茁增重、叶片数方面均高于非转基因对照烟草。转柽柳MT基因烟草能够在Cda2浓度为100,umol·L．1培养基上生长良好，平均增重是非转基因对照的3．07倍，平均根长是非转基因对照的1．96倍；转柽柳、星星草MT基因烟草能够在CdCl2浓度为200,umol·r1培养基上生长，平均增重是非转基因对照的3．85倍，平均根长是非转基因

7、对照的2．74倍；而非转基因对照烟草在CdCl2浓度为100,umol·L．1时就表现为生长缓慢，根系受到明显抑制。试验表明转双价MT基因烟草比转单价MT基因烟草具有更强的CA抗性。证明了外源MT基因可以在烟草子一代中遗传，该基因的表达提高了烟草对Cd胁迫的耐受能力。关键词柽柳；星星草；烟草；MT基因AbstractHeavymetalpollutioninsoilhasbeenaseriousproblemandamatterofgreaturgencytoresolveinourcounty．Studyingtheheavymetaltolerancemec