柽柳抗逆分子机理的研究和相关基因的克隆

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1、摘要柽柳是抗逆能力强的植物，可以在于早和盐渍化土壤上良好生长。以柽柳为主要研究材料，应用差异显示、消减杂交、EST分析、基因芯片等技术研究其抗逆分子机理-并对部分抗逆基因进行克隆。建立了两种木本植物总RNA的提取方法。两种方法均以硼砂为缓冲液，分别用SDS、和CTAB为主要提取试剂，可以提取出高质量的木本植物总RNA；SDS方法同时可以用于真菌、昆虫等的RNA提取。对LiCl沉淀方法进行了重要改进，改进的方法可在10min内完全沉淀RNA。用差异显示技术研究了NaHC03胁迫下柽柳的基因表达情况，经Northern检测共获得了17个基因片段，BlastX分

2、析表明，有2个基因与F-box类蛋白家族成员同源性较高。1。个基因与翻译起始因子elF成员有高的同源性。还获得了分别与分泌型过氧化物酶和过氧化物酶基因同源性高的基因片段，过氧化物酶为植物对抗逆境胁迫的常见基因。另外，有5个与盐碱胁迫密切相关的新序列，它们在胁迫前后差异表达明显。这17个序列的GenBank接受号为CD028574．CD028581和CD028583一CD028591。应用消减杂交技术研究了NaHC03胁迫下柽柳的基因表达情况，以NaHC03胁迫柽柳eDNA为试验方(tester)，正常生长柽柳cDNA为驱动方(Driver)。经Northe

3、rn杂交检测，共获得36个盐胁迫应答基因。BlastX分析表明，它们与下列基因同源：CAT和PRDX2个抗氧化酶基因：编码海藻糖磷酸酯酶的基因；多种调控基因，包括bZIP转录因子、MADS—box蛋白，富含甘氨酸RNA结合蛋白(Glycine—richRNA．bindingproteins)、CCCH型锌指蛋白、F-box蛋白等的调控基因；早期光诱导蛋白，该基因可以修复由胁迫引起的植物光合系统损伤；半胱氨酸蛋白酶和VPE酶(vacuolarprocessingenzyme)，它们起降解受损细胞作用；以及脂质转移蛋白前体、聚合泛素、查尔酮合酶、谷胱甘肽转移酶

4、、NADP一／DH、OEEl等；同时，发现了6个盐胁迫应答的新基因。用差异显示技术研究了NaHC03胁迫下星星草的基因表达情况，经反向Nortbem检测，获得了7个差异表达基因片段。其中，6个为胁迫后诱导表达的基因，1个为胁迫后抑制表达的基因。序列同源性分析表明，诱导表达的6个基因中，1个与钙依赖性蛋白激酶(CDPK)同源性较高，其余5个为新序列，胁迫后抑制表达的基因与假定adaptor蛋白同源性较高。结果提示，在NaHC03胁迫后，星星草可能通过CDPK正向调控其抗盐能力，并调控胁迫信号的转换。获得的7个基因片段已经在GenBank登录，登录号为CFl9

5、8398--CFl98404。构建了柽柳的cDNA文库。以NaHC03胁迫的柽柳为材料建立了cDNA文库，文库的初始滴度为5．7x105p如，重组率为96％，插入片段平均长度约1．2kb，扩增后文库的滴度为3．9x109pfu／mL。对柽柳进行了EST分析，共获得2455条ESTs序列，它们代表了1936条无重复的单～序列(uniquesequence)a共有1452条ESTs与己知基因序列同源，其中：1452条ESTs与Nr数据库蛋白同源，其余1386条为新序列。对EST进行了GO(Oene========：=!====：。===============

6、=======!=======；======；=一Ont0109y)分类，将这些ESTs分成了分子功能、生物学途径和细胞组件三部分，同时进行了pathway分析，共发现了125个生物学途径。已知ESTs按功能分为12类，其中代谢占18．53％、防御占18．80％、蛋白质合成占6．75％、能量占4．61％、转运占6．75％、蛋白质定向占7．09％、信号转导占5．17％、细胞生长、分裂占4．61％、转录占6．75％、光合占8．82％、细胞结构占1．79％、功能未知占10．33％。共发现了近400个与抗逆相关的EST序列，分析显示柽柳抗逆是个多途径作用的复杂体系

7、，涉及胁迫信号转导与基因的表达调控、活性氧清除、水分和离子的转运、渗透调节、脱水保护等多种途径。用基因芯片技术研究NaHC03及干旱胁迫下柽柳基因的表达。将Cy5一dCTP分别标记在干旱和NaHC03处理柽柳的eDNA上，Cy3一dCTP标记在对照柽柳eDNA上。通过探针与芯片杂交，通过对两种杂交信号强度比值的分析研究基因的差异表达，获得了柽柳的干旱胁迫的基因表达谱和NaHC03胁迫的基因表达谱。其中，NaHC03胁迫共获得了89个差异表达的基因。其中，27个下调表达和62个上调表达的基因。BlastX分析表明这些基因按功能可以分为光合作用、活性氧清除、渗

8、透调节、信号传导与表达调控、代谢、发育相关、核糖体蛋白、蛋白质的分