柽柳根部响应高盐胁迫基因表达谱的建立及相关基因克隆

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1、摘要柽柳(Taram／xsp．)具有强的耐盐碱能力，是进行植物耐盐碱机理研究的理想材料．为研究盐胁追下柽柳根部的耐盐机理，本研究以0．4moFLNaCl胁迫处理刚毛柽柳(Tamar／x

2、jl豇讲如)根部组织为试材，分别构建对照及胁迫24h、48h的3个eDNA文库．3个文库的初始滴度为1．0xl旷pfu、1．4xl护pill、1．2xl妒pfu，插入片段平均长度分别为0．8曲、0．9kb、0．85kb，平均重组率为98．2％。通过对3个eDNA文库克隆的随机测序共获得7726条有效的EST序列，其GenBank注册号为EG966290EG974015，这些Es

3、T代表了4168条无重复的单一序列(uniquesequence)，其中包括1142条eontigs和3026条mglm。其中4508条EST与与NCBI的Nr数据库中的已知蛋白序列相似，并将它们按功能分成11类，占比例最高的是蛋白质合成类(proteinsynthesis)基因，约21．40,6，功能未知(Functionunknown)和转运类(Transportfacilitation)分别占15％和12．2％，代谢类(Metabolism)占11．2％、细胞防御(Cellresc∞，defense)占7．3％、能量(Energy)占7．O％、细胞结构类

4、(Cell$[I'uctul'O)6．8％、转录(Transcription)占5．1％、蛋白质定位(Proteindestination)4．8％、信号转导(Signaltransduetion)占4．1％、细胞生长份裂(Cellgrowth,di、dsion)占3．7％。3个eDNA文库中共有860条EST与抗逆相关，其中，活性氧清除的基因(27％)、胁迫响应(16％)、细胞结构(16％)、蛋白质合成及降解基因(10％)，代谢和能量、信号转导及转运所占比例次之，转录调控和渗透调物质合成基因最少，各占3％。通过对3个文库的EST的分析及比较，发现共有106条

5、基因在NaCl胁迫前后呈差异表达，发现34条上调表达基因，27条下调表达基因，45条基因出现暂时差异表达，其中H+．AmP合成酶、ABA胁迫成熟蛋白、脂质转运蛋白、金属硫蛋白、类萌芽素蛋白、晚期胚胎富集蛋白类ERDl5和LEA5等基因胁迫后表达丰度上升；而细胞壁结构蛋白富含脯氨酸蛋白及木糖葡聚糖型内转运糖基化酶等基因胁迫后表达量下降；蛋白质翻译延伸因子EFla和翻译起始因子elf5a等基因胁迫后出现瞬时的上升或下降。采用实时荧光定量PCR技术，分别研究文库中获得的8种POD和7种水通道蛋白基因在NaCl胁追前后柽柳根和叶组织中的表达差异。结果表明，盐胁追后PO

6、D基因在柽柳根和叶组织细胞中的表达模式相同，在胁迫24h时出现瞬时抑制现象；水通道蛋白基因在盐胁迫在根、叶器官中有表达模式有明显的差异。盐胁迫后7种水通道蛋白基因在根部表达量上升；在叶部它们胁迫后表达量下降。从文库中克隆获得了25条抗逆相关基因的全长eDNA序列，这些基因这些基因分属于：细胞防御、离子平衡和转运、抗病、细胞壁成分、信号转导与调控、水分胁迫相关蛋白、蛋白质的合成与降解。．从盐胁迫下柽柳众多基因的表达特征信息可推断，柽柳根部对盐胁迫响应的过程可能是一个复杂的多基因协同作用的过程，涉及活性氧清除、细胞壁组分、胁迫信号转导与基因的表达调控、水分和离子的

7、转运、脱水保护等多种途径。从而为系统阐明柽柳抗盐分子机理奠定坚实的基础。对刚毛柽柳抗逆基因的克隆，可为基因工程育种提移}优良的侯选基因。关麓词刚毛柽柳；根；盐胁迫；表达序列标签；基因表达谱；基因克隆Tw-angx腑垆翻玩abalophytewithhighcapa田ofsalttolerance，is锄excellentmodelplantinplantsalttolerm妣research．ThreeeDNAlibrarieswcrca眦ls岫lctcd丘啪theroottissuesofZh／sp／daofwell-wateredandexposedtoN

8、aCI(o．4MNaCI)for24and48h，respectively(named鹤conu-01．24and48hlibrary,respectively)．Averageprimaryfiteroflhethreelibraries啊憾1．0X106p氟1．4X106flu,1．2X106pfu,respectively,witharareofrecombinationabout98．％．PCRdetectionrevealedthattheiraverageimcrtssizewasrespectively0．8，0．9，andO．85kb．Atot

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