龙须菜热激蛋白基因克隆及在高温胁迫下的表达模式分析

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1、万方数据谨以此论文献给对我严格要求的导师，给予我无私关怀的父母和一直支持帮助我的实验室同学们。——丁艳万方数据万方数据万方数据龙须菜热激蛋白基因克隆及在高温胁迫下的表达模式分析摘要龙须菜是一种重要的大型经济海藻，是生产琼胶的原料，也可以作为鲍鱼的饵料，具有进行大规模栽培的价值。耐高温品种981和07-2龙须菜的培育，推动了龙须菜栽培业的发展，但是在实际栽培过程中仍然面临过高的海水温度会限制龙须菜的生长，导致溃烂甚至死亡等问题。为解决这些问题，培育性状稳定、耐热性更强的龙须菜新品种是必要的，这需要研究龙须菜对高温的应答机制。

2、研究表明，热激蛋白（HSP）是一类在生物体受到逆境胁迫时能提高机体耐受性的逆境蛋白家族，在减轻逆境胁迫对机体的伤害方面起到很大作用。本论文对龙须菜热激蛋白进行研究，旨在了解龙须菜的高温胁迫响应机制，为培育抗逆性更强的龙须菜新品系提供理论依据。本实验室前期通过构建龙须菜高温胁迫差异表达文库，获得了龙须菜hsp90的cDNA序列，在此基础上，本论文克隆了hsp90的全长序列，长为2605bp，只由一个外显子组成，开放阅读框长2100bp，上游调控序列为505bp。该基因编码699个氨基酸，含有N端保守的ATPase结构域，中间

3、结构域和C端是保守的5肽MEEVD。经Blast分析与角叉菜hsp90的相似性最高，达到87%。该基因序列在三种耐高温性能不同的龙须菜-野生型、981和07-2龙须菜中序列相同，通过southernblotting验证该基因在三种龙须菜中拷贝数也相同，均为两个拷贝。将本实验室前期获得的hsp70-1和hsp70-2与GenBank中的序列比对，发现与GenBank中报道的龙须菜hsp70序列不同，可见龙须菜中还存在第三种hsp70（命名为hsp70-3），但是对于hsp70-3仅有部分序列报道，在此基础上，本论文克隆了hs

4、p70-3的全长序列，长为2780bp，开放阅读框全长1867bp，基因上游调控区长416bp，下游侧翼序列长495bp。该基因编码621个氨基酸，含有保守的N端ATPase结构域和C端底物结合结构域。经Blast分析与细基江蓠hsp70的相似性最高，达到91%。本实验还通过分析10种管家基因—肌动蛋白基因(ACT)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)、延伸因子基因1(EF1)、转录起始因子基因(eIF)、组I万方数据蛋白H2B基因(H2B)、18S核糖体RNA基因(18SrRNA）、转录间隔区基因（ITS2）、胞色

5、素c氧化酶基因（COX）、细胞色素还原酶b5基因（CR）、藻红蛋白基因（PEB）在不同温度胁迫下的表达情况，获得了龙须菜在温度胁迫条件下合适的内参基因：a)32℃不同的热激处理时间实验，最适合的内参基因组合是eIF和ACT。b)8℃不同的低温处理时间实验，最适合的内参基因组合是GAPDH、ITS2、CR、18SrRNA。c)不同的处理温度实验，最合适的内参基因组合是eIF、EF1、ACT。d)龙须菜不同的生活世代实验，最合适的内参基因组合是GAPDH和ACT。采用荧光定量PCR的方法检测hsp90和hsp70-3在高温（3

6、2℃）胁迫下在野生型，07-2，981中的转录水平。hsp90在三种龙须菜中的变化趋势是一样的，均呈现先升高后降低再升高的趋势；从表达量上分析07-2型龙须菜中的表达量最大，981次之，野生型最低，这与三种品系龙须菜对温度的耐受性是一致的。hsp70-3在07-2型龙须菜中是下调表达的；在野生型和981型龙须菜中表达量是上升的，而且在野生型龙须菜中表达量最高。结合顾颖慧检测的hsp70-1、hsp70-2基因的表达情况可知，对于野生型龙须菜来说，hsp70-3可能是其响应高温胁迫II的主要HSP70蛋白；对于981龙须菜来

7、说，在高温胁迫下，其hsp70-1，hsp70-2和hsp70-3均表达上调，多种hsp70蛋白共同发挥作用保护细胞免受高温伤害，这可能是981龙须菜耐高温能力提高的原因之一。对于07-2型龙须菜，其hsp70-3的表达水平非但没有提高，还呈现出下调的特点，然而三种龙须菜中，07-2型龙须菜的高温耐受性最强，可能是07-2型龙须菜中其他高温胁迫响应元件的作用更大。本文首次对高温胁迫下龙须菜热激蛋白hsp90和hsp70-3基因进行克隆与表达分析，为阐述龙须菜高温胁迫响应机制奠定基础，并为选育抗逆性更强的龙须菜品系提供可用的

8、序列信息。关键词：龙须菜；高温胁迫；热激蛋白；荧光定量PCR；内参基因II万方数据Molecularcloningandexpressionanalysisofheatshockprotein90and70genesfromGracilarialemaneiformisunderhightemperat