龙须菜热激蛋白70hsp70基因克隆及热激下的表达模式分析

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1、龙须菜热激蛋白70(HSP70)基因克隆及热激下的表达模式分析Molecularcloningandexpressionanalysisofheat—shock—protein70(HSP70)genesfromGracilarialemaneiformisrmtsunruderheatlieatsnocK学位论文完成日期：塑!l：!：：兰鱼指导教师签字：巫坚塑答辩委员会成员签字：独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成

2、果，也不包含未获得(注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空)或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：≯龙a凌签字日期：加1f年岁月)伯学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下事项：1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中国学术期刊

3、(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入CNKI《中国知识资源总库》，授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者躲7》糯耄导师签字：弧睡幻签字日期：切11年多月馏日签字日期：为11年譬月_阳龙须菜热激蛋白70(HSPT0)基因克隆及热激下的表达模式分析龙须菜热激蛋白70(HSP70)基因克隆及热激下的表达模式分析摘要龙须菜(Gracilarialemaneiformis)是一种产琼胶的重要经济红藻，原产地为山东省和辽宁省，现在广东、福建、浙江等地已成功实现南移栽培。南移栽培

4、的龙须菜品系主要为981龙须菜，其适应海水温度可达260C，但其在南方自然海域仍不能成功渡夏，因此培育耐高温龙须菜新品系，研究龙须菜的高温胁迫响应机制一直是研究者关注的问题。热激蛋白(HSPs)是一类在生物体受到逆境胁迫时能提高机体耐受性的逆境蛋白家族，在减轻逆境胁迫对机体的伤害方面起到很大作用。HSP70是其重要组成成员，是提高生物体对温度耐受力的关键因子之一。本实验室前期通过构建龙须菜高温胁迫差异表达的eDNA文库，筛选得到了高丰度的龙须菜hsp70基因的表达序列标签，表明HSP70在龙须菜的高温胁迫响应中也起重要作用。本研究以耐高温品种981

5、龙须菜和野生型龙须菜为主要材料，采用RACE技术和GenomeWalking方法对龙须菜热激蛋白hsp70进行克隆，首次在龙须菜中获得两条hsp70基因(hsp70．1和hsp70．2)全长序列，推测得到其相应的氨基酸序列，并通过生物信息学的方法分析二者的结构特征和进化地位，使用荧光定量RT-PCR技术探讨981和野生型龙须菜在不同温度不同胁迫时间下，热激蛋白HSP70mRNA表达水平的变化规律。主要研究结果如下：获得两条hsp70基因序列(hsp70．1和hspTO．2)，均含有三个典型的HSP70家族的序列标签，且5’非编码区域(UTR)有TA

6、TABox和CAATBox，3’UTR区有PolyA寡聚腺甘酸。其中，hsp70．1基因全长2582bp，仅由一个外显子组成，开放阅读框(ORF)长1977bp，编码658个氨基酸，分子量约为71．69kD，5’UTR为484bp，3’UTR区为121bp，其中5’UTR含有热激元件HSE。hspZ0．2基因全长2843bp，也由一个外显子组成，ORF为2001bp，编码666个氨基酸，分子量约为72．88kD，5’UTR区730bp，3’UTR区112bp，有内质网定位序列HDEL。经NCBIBlastn比对二者的核苷酸相似性为69％，同源性比对

7、表明，龙须菜HSP70．1与条斑紫菜(Pophyrayezoensis)HSP70同源性最高，为92％；龙须菜HSP70．2与领鞭毛虫(Monosigabrevicollis)MbERHSP70同源性最高，为77％。热激后(280C和320C)，进行Real．timePCR结果表明：野生型实验组HSP70一l在热激短时间内表达量有所上升，而HSP70．2表达量始终低于对照组，且320C实验组比280C实验组表达量更低：981龙须菜实验组两种热激蛋白均龙须菜热激蛋白70(HseTo)基因克隆及热激下的表达模式分析呈现先上升后下降又上升的趋势，热激温度

8、越高，表达高峰到来的越早，表达量更大，而且随着热激时间延长，表达量将更高。HSP70．1的表达水平高于HSPT0．2，推测