紫花苜蓿热激蛋白基因mshsp70的克隆及功能分析

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1、密级：论文编号：中囯农北科学院学位论文紫花苜蓿热激蛋白基因的克隆及功能分析CloningandFunctionalAnalysisofMsHSP70GeneinMedicagosativaL.硕士研究生：栗振义指导教师：康俊梅副研究员申请学位类别：农学硕士专业：草学研究方向：牧草资源与育种培养单位：北京畜牧兽医研宄所研宄生院2015年4月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationCloningandFunctionalAnalysisofMsHSP70GeneinMe

2、dicagosativaL.M.S.Candidate：LiZhenyiSupervisor：AssociateProfessorKangJunmeiMajor：GrassScienceSpecialty:ForageGrassResourcesandBreedingApril2015I独创性声明II摘要热激蛋白（HSP）是一种具有广泛抗逆作用的保护性蛋白，主要作为分子伴侣在细胞保护、光合作用、遗传繁育和胁迫应激等过程中发挥重要作用。本文分析了紫花苜蓿热激蛋白基因MsHSP70的特性及功能，旨在为苜蓿遗传改良与抗逆品种选育提供理论依据。主要实

3、验结果如下：1、利用同源克隆法，从紫花苜蓿克隆了一个全长为2146bp热激蛋白基因序列，命名为MsHSP70（GenBankaccessionNo：KJ621409）。经生物信息学分析，该基因包含一个2028bp开放阅读框，可编码675个氨基酸，MsHSP70蛋白分子量为72.33KDa，蛋白二级结构主要由α螺旋、β折叠组成。多序列比对结果显示MsHSP70与截形苜蓿、豌豆、拟南芥HSP70的相似度分别为：94.47%、89.93%、78.72%。2、通过亚细胞定位分析及在线预测，MsHSP70基因可定位于线粒体，经过进化树分析可将MsHSP

4、70归类到线粒体HSP70家族。成功构建了MsHSP70基因原核表达载体并转入大肠杆菌，在IPTG诱导下在大肠杆菌中大量表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明MsHSP70原核表达蛋白分子量与预测结果一致。3、利用实时荧光定量PCR对MsHSP70基因在苜蓿不同组织和非生物胁迫下的表达模式进行了分析，结果表明，MsHSP70在紫花苜蓿的花中表达量最大，茎和叶次之，根中最少；MsHSP70基因的表达受高温、ABA、H2O2诱导，干旱和盐胁迫下基因表达量没有显著变化。4、构建了植物表达重组载体pCAMBIA1302-MsHSP70，并采用农杆菌介导法转

5、化了拟南芥和紫花苜蓿，经过抗性筛选和分子检测，初步鉴定已获得转MsHSP70基因拟南芥和紫花苜蓿。5、通过对转MsHSP70基因拟南芥中MsHSP70基因表达分析，结果显示MsHSP70基因受ABA、干旱和盐胁迫诱导表达；对T3代转基因拟南芥植株的抗逆性分析显示，与野生型相比，转基因拟南芥在ABA和干旱胁迫下均表现为：丙二醛（MDA）含量较低，脯氨酸含量较高，超氧化物歧化酶（SOD）活性较高，并且在干旱胁迫下转基因拟南芥相对含水量（RWC）高于野生型；在盐胁迫下转基因拟南芥与野生型各项生理指标没有明显差异；对转基因拟南芥苗期生长情况观测发现，

6、在ABA与干旱胁迫下，转基因拟南芥幼苗鲜重与根长均大于野生型，在盐胁迫下差异不显著；综上所述，在转基因拟南芥中，MsHSP70基因在ABA和干旱胁迫调节机制中起重要调控作用。关键词：紫花苜蓿，热激蛋白，亚细胞定位，表达量分析，遗传转化IIIAbstractHeatshockprotein(HSP)isakindofubiquitousprotectiveproteinthatplaysacrucialroleinplant.HSPactasamolecularchaperoneparticipatesincellprotection,phot

7、osynthesis,geneticbreeding,stresstoleranceandotherprocesses.WeanalyzedthecharacterizationandfunctionofHeatshockproteingeneMsHSP70fromalfalfainordertoprovidecandidategeneforgeneticimprovementandvarietybreedinginMedicagosativa.Themainlyresearchresultsareasfollows:1.Inthisstud

8、y,thehomologouscloningmethodwasusedinobtainingMsHSP70(GenBankaccessionNo：KJ621409)