MicroRNA-20a通过自噬通路调控乳腺癌发生的机制研究

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1、MicroRNA-20a通过自噬通路调控乳腺癌发生的机制研究(申请清华大学理学硕士学位论文)培养单位：生命科学学院学科：生物学研究生：刘磊指导教师：许乃寒副教授授二○一七年五月MicroRNA-20amediatedautophagydefectpromotesmammarytumorigenesisDissertationSubmittedtoTsinghuaUniversityinpartialfulfillmentoftherequirementforthedegreeofMasterofScienceinBiologyb

2、yLiuLeiThesisSupervisor:AssociateProfessorXuNaihanMay,2017摘要摘要本文系统性的研究了miR-20a通过抑制细胞自噬从而促进乳腺癌发生发展的分子机制。分析癌症基因组图谱（TCGA）中乳腺癌的基因表达数据发现在乳腺癌，特别是三阴性乳腺癌中miR-20a的表达上调。基因集富集分析（GSEA）表明miR-20a的表达与自噬/溶酶体途径负相关。乳腺癌细胞过表达miR-20a后，其基础水平与代谢压力诱导的自噬流活性被抑制，导致细胞内ROS水平升高，DNA损伤增加。当用LNA-20a抑

3、制内源性miR-20a时，细胞自噬水平与溶酶体活性升高。研究发现miR-20a可以靶向多个关键自噬调节基因，包括BECN1、ATG16L1与SQSTM1。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）与蛋白质免疫印迹实验（WesternBlot）发现miR-20a下调BECN1、ATG16L1、SQSTM1的mRNA与蛋白表达水平。荧光素酶报告实验确证miR-20a结合BECN1、ATG16L1与SQSTM1的mRNA的3’-UTR从而抑制基因的表达。沉默内源BECN1、ATG16L1与SQSTM1具有与miR-20a同样的效果，即细胞内

4、DNA损伤增加，ROS水平升高。引入外源性的BECN1、ATG16L1与SQSTM1解除了miR-20a对自噬的抑制作用，减少了DNA损伤。分析乳腺肿瘤组织样本发现，miR-20a与其靶基因的表达呈现负相关。而且，与其他亚型相比，低水平的BECN1、ATG16L1与SQSTM1在三阴性乳腺癌中更常见。具有较高miR-20a水平的乳腺癌患者中也检测到大量的基因组拷贝数的改变与DNA突变。最后，我们用三阴性乳腺癌细胞构建了异种移植小鼠模型，结果表明miR-20a较明显的促进肿瘤起始和生长。综上所述的研究结果证明miR-20a介导的细

5、胞自噬的下调可能是乳腺肿瘤发生过程中miR-20a致癌作用的新机制。这一研究结果加深了我们对乳腺癌发病机制的理解，并有可能有为乳腺癌的诊断与治疗提供一定的指导意义。关键词：miR-20a；细胞自噬；乳腺癌；DNA损伤；活性氧IAbstractAbstractInthisstudy,wesystematicallyinvestigatedthemolecularmechanismofmiR-20ainregulatingautophagyandmammarytumorigenesis.Geneexpressiondatafroms

6、tudiesofbreastcancerinTheCancerGenomeAtlas(TCGA)revealedmiR-20aisupregulatedinhumanbreastcancer,especiallyintriplenegativesubtype.GeneSetEnrichmentAnalysis(GSEA)suggestedthatmiR-20aexpressionnegativelycorrelateswithautophagy/lysosomepathway.Inthisstudy,weshowthatover

7、expressionofmiR-20asuppressesthebasallevelandmetabolicstressinducedautophagyandlysosomalproteolyticactivity,increasesintracellularROSlevelsandDNAdamageinbreastcancercells.Onthecontrary,LNA-modifiedmiR-20ainhibitorenhancesautophagyandlysosomalproteolyticactivity.Using

8、miRNAtargetspredictionsoftware,qRT-PCR,WesternBlotandluciferaseassaywedemonstratethatmiR-20adirectlytargetsseveralkeyregulatorsofau