AMPK通路介导自噬调控高糖环境下破骨细胞形成与功能机制研究

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1、分类号：R681单位代码：10159密级：公开学号：201520261硕士学位论文中文题目：AMPK通路介导自噬调控高糖环境下破骨细胞形成与功能机制研究英文题目：AMPKpathway-mediatedautophagyregulatesosteoclastformationandfunctioninhighglucoseconditions论文作者：蔡振煜指导教师：杨茂伟教授学科专业：外科学完成时间：2018年2月中国医科大学硕士学位论文AMPK通路介导自噬调控高糖环境下破骨细胞形成与功能机制研

2、究AMPKpathway-mediatedautophagyregulatesosteoclastformationandfunctioninhighglucoseconditions论文作者蔡振煜指导教师杨茂伟教授申请学位医学硕士培养单位第一临床学院一级学科临床医学二级学科外科学研究方向骨质酥松论文起止时间2017年12月—2018年2月论文完成时间2018年2月中国医科大学（辽宁）2018年2月I中国医科大学硕士学位论文摘要目的：物质生活的丰富与人类寿命的延长，使得慢性疾病对健康的威胁愈发占据

3、突出地位。其中，糖尿病是一种典型代表性疾病。糖尿病性骨质疏松是糖尿病的重要并发症之一,骨质疏松病的特点为骨吸收增多，同时骨形成减少，造成骨量减少和骨组织微结构改变导致骨质脆性增加和骨折风险增高。高糖血症是1型和2型糖尿病的共同特点，其可能是增加骨折风险的因素。普遍观点认为葡萄糖能促进破骨细胞分化并增强其功能，但是，一部分学者的研究表明高糖会对破骨细胞起到抑制作用。因此，在高糖对于破骨细胞的影响问题上仍然存在争议。自噬是一种主要负责消除受损蛋白和细胞器的过程，现在被广泛认为是一种抗衰老程序。并且，自

4、噬也被认为是一种维持细胞稳态的应激反应机制。自噬在破骨细胞中也起着重要作用。自噬蛋白Beclin-1通过诱导ROS和NFATc1基因的表达来作用于RANKL相关破骨细胞分化，同时，敲除Atg5，Atg7和LC3的破骨细胞出现细胞特异性蛋白CTSK的分泌和特异性皱褶结构形成的减弱。AMPK通路是一条主要的代谢调控通路，其激活与否与葡萄糖的多寡相关。同时，该通路可以通过调控下游mTORC1与ULK1元件对细胞自噬发挥作用。因此，本课题主要通过研究高糖环境对破骨分化和功能的影响，以及自噬在高糖环境下破骨

5、细胞分化与功能变化中的作用，同时观察相关信号通路的变化情况，探讨高糖环境影响破骨细胞分化和功能方面的分子机制。研究方法：使用CCK8试剂检测不同浓度（5.5,10.5,15.5,20.5,25.5,和30.5mM/L）的葡萄糖以及不同时间点（第1至第6天）对RAW264.7细胞活力的影响；使用WesternBlotting法检测不同糖浓度对诱导至第四天的破骨细胞组织蛋白酶K（CathepsinK，CTSK）表达水平；使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒检测不同糖浓度对诱导至第四天的破骨细胞个数的影响；

6、使用羟基磷灰石基质骨吸收孔板检测不同糖浓度对诱导至第四天的破骨细胞吸收能力的影响。使用WesternBlotting法检测低糖、高糖以及相应浓度添加AMPK通路抑制剂CompoundC下诱导至第四天的破骨细胞AMPK通路相关蛋白p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、p-ULK1和ULK1表达情况，同时检测此条件下自噬相关蛋白LC3I/LC3II和P62表达情况；使用WesternBlotting法检测低糖（5.5mM/L）和高糖（30.5mM/L）浓度下诱导至第四天的破骨细胞自噬相关蛋白

7、Beclin-1、LC3I/LC3II和P62的表达情况；使用透III中国医科大学硕士学位论文射电子显微镜观察低糖和高糖浓度下诱导至第四天的破骨细胞自噬体数量情况；使用免疫荧光染色观察低糖和高糖浓度下诱导至第四天的破骨细胞内源性点簇状LC3聚集情况；使用WesternBlotting法检测自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）和巴佛罗霉素A1（BafilomycinA1,BafA1）以及自噬激动剂雷帕霉素（Rapamycin,Rapa)作用下诱导至第四天的破骨细胞自噬

8、相关蛋白LC3I/LC3II和P62以及破骨功能蛋白CTSK表达情况；同时使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒检测此条件下对诱导至第四天的破骨细胞个数的影响。结果：从5.5mM/L至30.5mM/L的6组不同糖浓度培养基对RAW264.7细胞活力无显著影响，但是发现随着糖浓度的增加，破骨细胞功能蛋白CTSK表达逐渐下降，破骨细胞形成个数与骨吸收面积逐渐减少；低糖（5.5mM/L）和高糖（30.5mM/L）诱导培养基诱导破骨细胞形成4天后，与低糖环境相比，高糖条件下破骨细胞AMPK/mT