opg调控破骨细胞nf-κb通路的研究

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1、OPG调控破骨细胞NF．10B通路的研究TheregulationofOPGonNF--loBpathwayinosteoclast研究生：王世涛指导教师：刘宗平教授扬州大学兽医学院I临床兽医学内科实验室2012．5王世涛OPG调控破骨细胞NF．Id3通路的研究OPG调控破骨细胞NF．Id3通路的研究中文摘要机体维持骨组织不断更新，保持生命活力是依靠骨代谢完成的。骨代谢平衡一旦被打破，机体便会出现各类代谢性骨病，其中骨营养不良性疾病如骨质疏松主要是由破骨细胞(osteoclasts，OC)产生的骨吸收大于成骨细胞(osteoblasts，OB)产生的骨再建所引起的。研究

2、发现，当机体受到骨吸收刺激时，成骨细胞／基质细胞膜上表达的细胞核因子．KB受体活化因子配基(receptoractivatorofnuclearfactor-r,Bligand，RANKL)，通过与破骨细胞前体细胞膜上细胞核因子．1(B受体活化因子(receptoractivatorofnuclearfactor-r．B，凡蝌K)结合，促进OC的分化和成熟。核因子．rd3(NF．r．B)信号通路是参与调控OPG抑制OC分化成熟的信号转导通路之一，吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)作为NF．r,B特异性抑制剂被广泛应用。本研究采用OPG瓜ANK依ANKL调控途径在体外诱导破骨

3、细胞前体细胞凡州264．7细胞株生成OC，在此基础上研究OPG抑制动物OC分化成熟的NF-rd3信号转导机制，为从分子水平揭示动物骨营养不良性疾病的发生及防治提供理论依据。1．RAW264．7细胞培养及RANKL、OPG、PDTC对细胞增殖的影响RAW264．7细胞在DMEM培养基中，于5％C02，37。C培养箱培养。MTT法检测其生长曲线，发现随着时间的增加，细胞增殖速度逐渐增加，第3d进入对数增长期，第5d进入稳定期。通过MTT法，检测不同浓度RANKL(0、10、30、50、70ng／mL)、OPG(0、10、20、40、50ng／mL)和PDTC(0、10、50

4、、100、150pM)对该细胞增殖的影响。结果表明：不同浓度RANKL均抑制细胞的增殖，随浓度增加抑制作用增强，选取30ng／mL为实验浓度；OPG在0--．50ng／mL浓度范围内，对细胞增殖无明显作用，选取0、20、50ng／mL为实验浓度；不同浓度的PDTC均抑制细胞的增殖，随浓度增加抑制作用增强，选取100taM为作用浓度。2．RANKL体外诱导RAW264．7细胞株分化为OC及OPG的影响RAW264．7细胞以5×103ceUs／mL密度接种于96孔板，加入cL．MEM培养基，于5％C02，37"C培养箱培养，隔天换液，至第6d。5％多聚甲醛固定，以抗酒石酸酸

5、性磷酸酶(TRAP)试剂盒染色，其中含有三个或三个以上细胞核的TRAP阳性多核细胞即为OC。在此基础上，分组：A组为空白组，B组添加20ng／mLOPG，C组添加30ng／mLRANKL，D组添加30ng／mLRANKL+20ng／mLOPG，E组添加30ng／mLRANKL+50ng／mLOPG。扬州大学硕士学位论文Il一诱导至第6d，5％多聚甲醛固定，TRAP试剂盒染色，生成的OC计数，结果表明：A、B组只有极少量的OC生成；C组生成TRAP阳性多核细胞数量极显著高于其他组(尸<0．01)：D组生成TRAP阳性多核细胞数量极显著低于C组(P

6、、B、E组(户<0．01)；E组生成TRAP阳性多核细胞数量极显著低于C、D组(P<0．01)。由此可见，C、D、E组在添加相同RANKL的基础上，随着添加OPG浓度的增加，OC数量逐渐减少，至50ng／mLOPG时，只有极少量的OC生成。3．OPG对OC形成过程中NF．KB信号转导通路关键信号分子表达的影响在诱导RAW264．7细胞分化生成OC的过程中进行如下处理，A组为对照组，B组添加20ng／mLOPG，C组添加30ng／mLRANKL，D组添加30ng／mLRANKL+20ng／mLOPG，E组添加30ng／mLRANKL+50ng／mLOPG。提取细胞核蛋白、

7、浆蛋白和细胞全蛋白，通过蛋白印迹(WesternBolt)技术检测NF．r,Bp65及IrB的表达。结果表明，实验组NF．r,Bp65表达量随添加OPG浓度的增加而降低，细胞Ird3et、IIcBB表达量逐渐增加。添加100gMPDTC阻断NF．rB信号转导通路后，检测上述关键信号分子的表达。在诱导RAW264．7细胞分化生成OC的过程中进行如下处理，A组添加100gMPDTC，B组添加20ng／mLOPG+100gMPDTC，C组添加30ng／mLRANKL+100gMPDTC，D组添加30ng／mLRANKL+20ng／mLOPG+1