urg4urgcp激活nf-κb通路调控肝细胞癌血管增生的实验研究

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1、博士学位论文NF．rd3表达上调，并通过ERK／NF．vd3促进MMP9和VEGF表达。NF．rd3激活对TGF．p／Smad7、JAK／STAT3、AKT／NFKB，NFKB／STAT3等信号的网络调控尚不清楚。有研究发现URG4／URGCP可以诱导NF．1(B高表达，URG4／URGCP在肝癌中对细胞信号通路的激活及对肝癌血管生成的影响有待进一步探讨。基于上述背景，本文研究目的即：(1)探索URG4／URGCP是否通过激活NF．vd3信号通路来促进肝细胞癌血管增生及其可能的分子机制。(2)探讨URG4／URGCP是否有可能成为肝细胞癌诊断治疗的潜在靶分子。方法通过蛋白免疫印迹和实时荧光定

2、量PCR实验检测URG4／URGCP在HCC细胞系和正常肝上皮细胞系的表达。使用脐静脉内皮细胞(HUVEC)．血管生成、迁移实验及鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验来检测URG4／URGCP过度表达或敲除的细胞系的血管生成能力。用荧光素酶报告方法来检测NF．vd3的转录活性。使用过度表达抗降解的NF．rd3抑制剂Ir,Ba突变体来抑制NF．rd3的活性。采用实时荧光定量PCR检测VEGFC，TNF．仪，IL．6，IL。8和MYC的表达水平。采用ELISA法检测VEGFC蛋白表达水平。具体方法如下：l、载体构建、逆转录病毒包装和转染。用PCR扩增人类全长的亚克隆URG4／URGCP序列并克隆到pMS

3、CV-retro．puro载体中形成URG4／URGCP表达载体。为了敲除URG4肘RGCP基因，使用针对人URG4／URGCP基因的序列的siRNA，将其克隆到pSuper-retro-puro质粒上形成URG4-Ri。逆转录病毒生成和感染参考Hahn等(MolCellBi01．2002)报道的方法。URG4／URGCP表达载体、URG4．Ri载体及NF．v,B抑制剂表达载体pBabe．Puro．Ivd30【_．rout[可生成抗降解的1出抑制剂(IKB)．仪突变蛋白(Ivd3a—rout)]利用脂质体包埋法(脂质体2000瞬间转染)转入HCC一细胞。2、实时荧光定量PCR检测URG4／U

4、RGCP、VEGFC，TNF．仪，IL．6，IL．8和MYC的表达水平。用TRIzol试剂提取细胞总RNA，取299RNA利用随机引物合成cDNA。实时荧光定量PCR在ABI7500上进行。步骤为：预变性95。C，TTT万方数据中文摘要10min，接着进行28个PCR循环包括95。C60s，580C30s，720C30s，最后720C5min。目的基因的表达水平采用与内参GAPDH比较的相对法计算，公式为2．[(QofGenes)。(CtofGAPDH)]。3、蛋白免疫印迹检测uRG4／URGCP等蛋白表达。提取细胞总蛋白并在100℃加热5min。取20lag蛋白利用SDS．PAGE电泳分离

5、，PVDF膜电转，脱脂奶封闭后利用多克隆兔抗URG4抗体，抗IKK抗体，抗plKK抗体，抗Ivd30t抗体或抗p-Ivd3a抗体进行杂交，剥胶后利用13,．Tubulin抗体再杂交作为上样对照。4、HUVEC血管生成实验。24孔板中每孔加入2009l基质，37。C聚合30分钟。吸取HCC细胞系培养液上清，与HUVECs混合，制成细胞悬液，吸取2001al(约含HUVECs2×104)加入每孔，370C，5％C02孵育24h。光学显微镜放大100倍拍照，毛细血管的生成能力通过测量每张图片的毛细血管生成数来进行定量分析。5、鸡胚尿囊膜(CAM)实验。CAM实验使用8天龄的受精鸡蛋。每个蛋壳表面开

6、个1cm直径的孔，去除外壳膜以暴露CAM。在CAM上放置0．5cm直径的过滤纸，将1009l从HCC细胞系培养液中收集的CM(条件培养液)或从加入空载体的对照细胞中收集的CM加到滤纸的中间。鸡蛋在37。C、相对湿度80。90％环境下培养48h，然后用灭菌绑带把孔封闭上。接着用固定液(甲醇1：1丙酮)固定15Min后，对CAM进行离体并用数码相机拍照。实验组中二级和三级血管的数量通过与对照组比较算出相对值。6、HUVECtranswell迁移实验。HUVECs与含5％FBS的CM混合，把约1×104HUVECs加到聚碳酸酯材料的transwell过滤器的上部。下部的室中加入5009l含15％F

7、BS的培养基。在37。c99育20h，把迁移到下层膜表面的细胞用4％多聚甲醛固定，苏木精染色15min，对10张随机选择的200倍视野下的滤纸进行计数，并与对照组比较计算出相对值，7、荧光素酶报告分析NF．rd3转录活性。用pNF．vd3．荧光素酶报告和对照载体来检测NF．vd3的转录活性。加三份1．5x104HCC细胞到24孔板中贴壁生长，用脂质体2000将100ng荧光素酶报告载体或对照载体及lngpRL