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时间:2019-05-17
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1、分类号:Q3学校代码:10697密级:公开学号:201520855硕士学位论文MASTER’SDISSERTATIONBRWD3蛋白复合物参与转录调控机制的解析学科名称:遗传学作者:强旭指导老师:李军林副教授西北大学学位评定委员会二〇一八年1二〇一七年二〇一七年TheanalysisofBRWD3proteincomplexinvolvedintranscriptionalregulationAthesissubmittedtoNorthwestUniversityinpartialfulfillmentofther
2、equirementsforthedegreeofMasterinGeneticsByQiangXuSupervisor:Jun-LinLiAssociateProfessorJune2018摘要既往研究指出BRWD3(BromodomainAndWDRepeatDomainContaining3)基因突变导致智力残疾(Intellectualdisability,ID)的发生,但作为重要的染色质修饰分子和转录调控因子,其作用机制不明。BRWD3由WD40和bromodomain这两类重要的结构域组成,可以通过bro
3、modomain特异性识别乙酰化赖氨酸,负责结合于特定的染色质靶位。为研究BRWD3在转录调控过程中的作用机制,本研究采用酵母双杂交系统和生物膜干涉技术解析BRWD3蛋白复合物组成;采用ChIP-seq、RNAi、报告基因等手段,研究BRWD3对下游ID相关基因的转录调控作用。研究结果如下:(1)从人胚胎脑组织cDNA文库,以BRWD3的bromodomain结构域所在片段作为诱饵,经酵母双杂交实验结合测序筛选得到12个阳性结果;选择与智力残疾相关的NUFIP1蛋白进行后续研究。(2)将BRWD3的bromodoma
4、in所在区域序列和NUFIP1编码序列分别构入原核表达载体;进行原核蛋白表达条件优化、诱导表达以及纯化;经生物膜干涉技术检测,随着NUFIP1浓度的升高,BRWD3的结合信号不断增强。BRWD3和NUFIP1分子间的亲和力常数K2D不随浓度的变化而变化,KD为9.12E-08(R=0.967)。在体外验证了BRWD3和NUFIP1存在相互作用。(3)为筛选BRWD3调控的下游基因,将pcDNA3.1-2Brd转染于细胞系,采用ChIP-seq法筛选到BRWD3可能结合的下游基因有5874个基因。为了解BRWD3突变对
5、ID的影响,我们分析筛选到可能有19个受BRWD3调控的ID相关基因。(4)为分析BRWD3和NUFIP1相互作用是否参与候选ID基因转录,采用RNAi分别敲低BRWD3和NUFIP1后,实时定量PCR法检测发现SETD5、SMARCB1、RLIM、SOBP、THOC2、MEF2C六个基因转录水平也随之显著性下调,而ELP2出现显著性上调。随后通过ChIP-PCR、Q-PCR和双荧光素酶报告基因方法发现BRWD3和NUFIP1结合于MEF2C启动子区,调控转录。本研究解析了染色质修饰因子和转录调控因子BRWD3与NU
6、FIP1对MEF2C转录调控,为理解BRWD3突变导致ID发生的机理提供线索。局限性在于BRWD3可能还I和其它蛋白质相互作用,通过调控下游基因转录,影响神经元活动、神经系统发育和成熟等。关于BRWD3如何影响神经系统发育,仍需深入开展相关研究。关键词:智力残疾;BRWD3;NUFIP1;相互作用;转录调控IIABSTRACTPreviousstudieshaveshownthatBRWD3(bromodomainAndWDRepeatDomainContaining3)mutationmayleadtointell
7、ectualdisability(ID),butasanimportantchromatinmodifyingmoleculeandtranscriptionfactor,itsmechanismisunknown.BRWD3iscomposedoftwoimportantdomains,WD40andbromodomain,respectively.Itcanspecificallyidentifyandbindacetylatedlysinetospecificchromatintargetswithbromod
8、omain.InordertostudytheroleofBRWD3inthetranscriptionalregulationprocess,weexploredthecompositionofBRWD3proteincomplexbasedonyeasttwohybridsystemandbiolayerinterferometrytech
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