从全基因组水平研究pml-rarα融合蛋白的转录调控机制

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1、上海交通大学博士学位论文从全基因组水平研究PML-RARα融合蛋白的转录调控机制姓名：王萍申请学位级别：博士专业：遗传学指导教师：张济;王侃侃20070501上海交通大学医学院2007届博士研究生学位论文从全基因组水平研究PML．RARa融合蛋白的转录调控机制摘要基因转录调控是生命科学研究的核心，其无论对于了解正常的生理发育还是异常的疾病发生过程都有着非同寻常意义。而染色质免疫沉淀与高通量基因芯片相结合的ChIP．on-chip(chromatinimmunoprecipitationOilchip)技术则

2、使得人们能够从全基因组水平研究转录因子的结合位点，从而为全面、系统性地研究基因的转录调控网络提供了一种强有力的手段。在与疾病发生相关的模型中，急性早幼粒细胞白血病(acutepromyelocyticleukemia，APL)中PML-RARa融合蛋白(异常转录因子)堪称是最佳的模型。该融合蛋白能够与体内正常的转录因子维甲酸受体(RARa)发生竞争、并与其在DNA上的结合序列一维甲酸反应元件(RARresponseelement，RARE)进行结合、产生显性抑制(dominantnegative)的效果，从

3、而对一系列与造血细胞分化相关的RAR0t所调节的靶基因产生表达抑制效果，使得细胞停滞在早幼粒细胞阶段、形成白血病。而全反式维甲酸(alltransretinoicacid，A1限A)则在相当程度上可以逆转PML广RAR旺的显性抑制效果、能够重新激活与造血细胞分化相关的维甲酸受体所调节的靶基因。尽管在过去的近二十年中，PML-RARa的研究取得了一系列重要的进展，但人们对于PML-RARa所直接涉及的转录调控网络了解甚少，尤其在PML-RARa所调控的靶上海交通大学医学院2007届博士研究生学位论文基因方面更

4、是缺少系统、全面性的研究，缺乏PML-RARct与下游功能性及转录调控网络的有机联系。因此，本课题以体外转染PML-RARct的细胞U937．PR9为模型，建立了ChIP以及ChIP．on—chip等技术平台并结合相应的转录组数据，从全基因组的水平系统性地研究了PML-RARa异常转录因子所潜在调节的靶基因、并就相关的下游功能性通路进行了较为全面的讨论。ChIP．on．chip技术的成功与否在很大程度上取决于前期ChIP过程的成功与否。因此，本课题首先就该过程中的各主要环节进行了严格的质控，并通过分析、验证

5、，建立了统一的标准，从而使得ChIP技术在本实验室成为继基因芯片技术、相关生物信息技术之后的又一稳定的技术平台。高质量的ChIP平台为高质量的ChIP．on．chip提供了保证。通过对全基因组转录调控区域的扫描，本课题共识别了2365个PML广RARa的蛋白结合位点，代表了1501个潜在的靶基因。同时，这些结合位点在基因组内的分布也呈现出一定的规律性：如约60％以上结合位点都分布在转录起始点(transcriptionalstartsites，TSS)周围(上游．2000bp．+2000bp)。而这种分布与

6、为数不多、已报道的转录因子的结合位点分布情况十分吻合。这从另一方面也反映了本研究的可靠性。由于ChIP．Oil．chip技术本身存在着假阳性率高、以及部分结合位点的生物学基础不明朗的原因，本课题将“静态”的ChIP．Oil．chip数据与“动态”的转录组数据(如APL临床样本、APL临床样本体外A：rRA用药、NB4细胞ATRA用药、APL转基因小鼠ATRA用药等表达谱芯片数据)进上海交通大学医学院2007届博士研究生学位论文行有机的整合，并进行相应的统计学处理。只有那些即出现在ChIP．Oil．chip数

7、据中又出现在各种APL相关的表达谱数据中、同时在统计学多重假设检验中具有显著性差异的基因才被认为是PMLRARa所调节的靶基因，其中包括：与细胞增殖分化相关的BAG．J、BCL2A1，CFLAR、CLCFl和MCLl等基因；与染色质结构重塑相关的CHDl，CHD3，CHD4和HMGB2等基因；与转录调控相关的BHLHB2、侬用、1RF2，ID2．CEBPE和LM02等基因；以及和泛素蛋白酶体系统相关的UBC，UBR2、PSMB8和PSMBl0等基因。上述基因所涉及的功能性网络大多数在PML-RARa存在的情

8、况下受到抑制，从而导致正常的血细胞分化受阻、增殖失控。而ATRA用药则在相当程度上解除了这种抑制、恢复了细胞分化的潜能。本研究的相关发现不仅有助于深入了解APL发生、及ATRA用药恢复过程中分子网络的变化，更重要的是为研究其它恶性肿瘤相关的转录调控网络奠定了理论基础、提供了研究依据。关键词：ChIP—Oil—chip，PML-RARa，转录调控，急性早幼粒细胞性白血病上海交通大学医学院2007届博士研究生学位论文