apobec3g转录调控机制的研究

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1、博士学位论文APOBEC3G转录调控机制研究博士研究生：李晖指导老师：侯金林(教授)摘要研究背景载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽3G(APOBEC3G)是最近发现的胞嘧啶脱氨酶家族成员，由384个氨基酸组成，分子量为46kD，共含有两个胞嘧啶脱氨酶结构域，可以催化单链DNA胞嘧啶脱氨基生成尿嘧啶。APOBEC3G是重要的天然免疫因子，参与机体的抗病毒防御，APOBEC3G在病毒包装过程中以出芽的方式包装入病毒颗粒，随感染病毒颗粒进入新感染细胞发挥作用。APOBEC3G通过催化HIV和HBV等逆转录病毒基因组发生dC脱氨基生成dU或直接抑制病毒逆转录酶活性而发挥抗病毒作用。APOBEC

2、3G可以在肺脏、肝脏、脾脏、睾丸、卵巢等组织以及外周血粒细胞和淋巴细胞中广泛表达，但是对于A3G转录水平调节的研究甚少，目前的研究主要集中在肝细胞和淋巴细胞中的表达调控。研究表明佛波酯可以通过PKCct／DI／MEK／ER途径诱导AOPBEC3G的表达；IFNa则可以通过不依赖STATl途径诱导AOPBEC3G的表达；IFN7、IL2、ILl5和IL7等多种细胞因子亦可诱导A3G转录。HCV病毒也可以影响APOBEC3G的表达，其NS5A蛋白可以激活APOBEC3G的转录从而上调APOBEC3G蛋白表达。核转录因子Spl和Sp3可以与APOBEC3G启动子区域的GC—box结合，参与

3、APOBEC3G基本转录的调控。但是对于其他核转录因子对APOBEC3G转录的调控以及HBV能否影响AOPBEC3G的转录则未见报道。研究目的：l、研究上游激活转录因子1(upstreamstimulatorytranseriptionfactorl，USFl)基因对APOBEC3G的转录调控作用。中文摘要2、研究HBV对APOBEC3G转录调控的影响。研究方法：1、通过在线软件对AOPBEC3G启动子全长分析，寻找潜在的转录因子结合位点。2、pcDNA3．1(+)一USFl载体构建：抽提HepG2细胞总RNA，逆转录成eDNA，PCR扩增USFl基因后连接到pMDl8．T载体，以M

4、13F和M13R为引物PCR鉴定有目的片段插入证明pMD-USFl载体构建成功，测序并与UCSC数据库序列比对正确无误后抽提质粒，用BamHI和XhoI双酶切连接到真核表达载体pcDNA3，1(+)上构建peDNA_3．1(+)一USFl重组体，大量抽提质粒，转染Huh7细胞48小时后提取细胞总蛋白通过westernblot鉴定其表达情况。3、过表达USFl基因对A3G的影响：分别以peDNA3．1(+)和peDNA3。1(+)一UFl质粒瞬时转染Huh7细胞，转染后48小时抽提细胞总RNA，用Real—timeRT-PCR检测APOBEC3GmRNA的变化；分别以peDNA3．1(

5、+)和pcDNA3，l(+)一SUFl质粒转染Huh7细胞，加入G418筛选稳定转染细胞系，抽提细胞总RNA，用Real—time五界PCR检测APOBEC3GmRNA的变化。4、降低USFl基因表达对APOBEC3G的影响：合成USFl小干扰RNA片段瞬时转染Huh7细胞，转染后48小时提取细胞总蛋白通过westernblot检测对USFl基因的干扰效果。提取细胞总RNA，用Real．timeRT-PCR检测APOBEC3GmRNA的变化。5、利用双报告基因系统检测USFl基因对APOBEC3G启动子的影响：pcDNA3．I(+)和peDNA3．I(+)一UFI质粒分别与pGL3-

6、A3G载体共转染Huh7细胞和HepG2细胞，在转染过程中为平衡转染效率，加入phRL．SV40质粒作为内参同时为了保证转染的DNA分子数和质量数一致，加用鱼精DNA补足质量。转染后48小时裂解细胞检测双萤光素酶的活性，观察在不同细胞中USFl基因对APOBEC3G启动子的影响，保持转染DNA总量以及pGL．A3G的量不变的情况下，采用不同剂量的pcDNA3．1(+)一USFl质粒与pGL．A3G质粒共转染Huh7细胞，观察USFl基因对APOBEC3G启动子影响的剂量效应。II博士学位论文6、确定USFl基因在APOBEC3G启动子上的作用位点：对APOBEC3G启动子全长进行分析

7、，根据APOBEC3G启动子上E．box序列所在位置，设计引物PCR扩增一系列5’截短的APOBEC3G启动子序列扩增位点分别位于转录起始位点上游．1130、一795、-232、．159、一84和一54处，酶切后连接到pGL3载体上，测序确认与与GenBank登录序列一致然后抽提质粒分别与pcDNA3．1(+)和pcDNA3．1(+)．SUFl质粒共转染Huh7细胞，检测双萤光素酶的活性，确定在APOBEC3G启动子上可能与USFl蛋白结合的E—box位点