癌蛋白p28gank的转录调控机制研究

《癌蛋白p28gank的转录调控机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、第二军医大学博士学位论文癌蛋白p28Gank的转录调控机制研究姓名：粟波申请学位级别：博士专业：肿瘤学指导教师：王红阳20120514第二军医人学博I：学位论义中文摘要癌基因p28Gank的转录调控机制研究博士研究生粟波导师王红阳专业：肿瘤学(东方肝胆外科医院国际合作信号转导实验室上海200438)摘要【研究背景及目的】肝癌的发生与多种病原引起的慢性肝炎密切相关。慢性炎症微坏境中的炎性因子如TNFa，IL一113，IL6等在促癌过程起到重要作用。IL-lp是NF．KB信号通路及其他信号通路的强效促炎性因子，NF．KB信号通路在癌前细胞或

2、炎性细胞内的激活被认为是慢性肝炎与肝癌之间的根本联系。IL．1B发挥生物学功能主要是同跨膜受体IL．1RI结合后，IL一1RI招募MyD88。MyD88再招募IL．1受体相关激酶IRAK4和IRAKl；IRAK4磷酸化IRAKl，并将IRAKl释放入胞质中，从而IRAKl同TRAF6等形成复合物，激活NF．KB或Jun信号通路。p28Gank(也被称为p28、Gankyrin、PSMDl0)是2000年首次在肝癌中发现的癌蛋白。本实验室前期的研究表明HCC中高表达p28Gank是不良预后和短生存期的预测因子，可以使癌细胞发生EMT。过表

3、达p28Gank可诱导细胞锚定非依赖性生长和侵袭转移能力提高。p28Gank可以结合I№促进其磷酸化和降解；还可以同MDM2结合，促进p53的泛素化降解：p28Gank可激活AKT／P13K／HIFl途径促进肝癌转移。作为癌基因，p28Gank至今未发现有突变。P28Gank驱动的肿瘤发生基本是由HCC中p28Gank异常高表达引起的。研究p28Gank的转录调控机制对于理解肝癌发生机制具有重要意义。【实验方法】1．生物信息学方法分析p28Gank启动予区并构建p28GANK报告基冈质粒及缺失突变质粒；2．运用双荧光素酶报告基因系统筛选

4、对p28Gank转录活性有影响的药物。采用I第一：军医人学博Ij学位论义中文摘要荧光定量PCR和WesternBlot对药物作用加以验证。3．采用凝胶阻滞实验(EMSA)研究p28Gank启动子结合蛋白，通过竞争性EMSA确定蛋白结合位点及结合转录因子家族，通过SupcrShiftEMSA确认结合转录因子和转录辅因子类型。4．采用染色质免疫共沉淀(ChIP)确认转录因子和转录辅因子在胞内对p28Gank启动子的结合。5．通过p28GankLuciferase报告基因质粒与其它如p300，CBP,IRAKl，HDACI，HDAC2表达质粒

5、共转染，研究p300，CBP,IRAKl等对p28Gank转录的诱导功能。6．采用RNA干扰技术，即p28GankLuciferase报告基因质粒与NFYA，NFYB，CBP,p300，IRAKlsiRNA共转染反向验证NFYA，NFYB，CBP,p300，IRAKI对p28Gank转录的诱导功能。7．运用核浆分离技术及WesternBlot，检测HEK293经刺激后，NFY-p300／CBP分子在胞核胞浆中的分布和变化；8．采用免疫共沉淀技术和WesternBlot研究NFYA乙酰化程度；9．采用DEN诱导的大鼠肝癌模型，研究从肝炎，

6、肝硬化发展至肝癌过程中IL-l}／IRAKI信号通路的激活情况及对p28Gank转录表达的影响；10．采用荧光定量PCR，WesternBlot和免疫组化研究p28Gank和IRAKl在正常肝、肝硬化、癌旁组织及肝癌组织的表达，采用Kaplan．Meier方法分析生存期。【实验结果】1．生物信息学分析：p28Galll(启动子属于双向TATA—lesspromotor，其核心启动子具有INR．DPE结构。2．构建了p28Gank启动子Luciferase报告基因质粒pGLA-p28Gank-1295bp—Luc和pGL4．p28Gank

7、一280bp—Lue及其四个突变体pGIA-Gankynn295bp—Luc，pGIA-GankyrinAcSQ2-Luc，pGL4-GankyrinAINR-Lue，pGL4一GankyrinADPE·Luc，确定了p28Gank的最小核心启动子范围。证实了主要p28Gank启动子顺式元件的功能。3．运用双荧光素酶报告基因系统筛选对p28Gank转录活性有影响的药物，发现第二军医人学博Ij学位论文中文摘要表皮生长因子(EGF)和白介素1B(IL-1B)可促进p28Gank转录，发现ClassI＆II型组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA和Na

8、Bu可提高p28Gank转录，蛋白酶体抑制剂MG-132和钙通道阻滞剂苯磺酸氨氯地平(Amlodipine，AML)和粉防己碱(Tetrandrine，TET)可抑制p28Gank转录。4．采用凝胶阻滞实验