癌蛋白p28gank对肝癌前体细胞的调控作用及机制研究

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1、第二军医大学博士学位论文癌蛋白p28GANK对肝癌前体细胞的调控作用及机制研究姓名：钱尤雯申请学位级别：博士专业：肿瘤学指导教师：王红阳201205癌蛋白p28GANK对肝癌前体细胞的调控作用及机制研究摘要研究背景和目的前体细胞，又称为干细胞，是一类具有自我更新和多向分化潜能的特殊细胞，前体细胞的自我更新和分化受到严格调控，如果这种调控机制发生障碍，细胞就会相对无止境地生长、繁殖，形成肿瘤。由此可知，正常前体细胞可能通过累积基因突变获得不确定的分裂繁殖能力，转化为肿瘤前体／干细胞(tumor-initiatingcells／cancerstemcel

2、ls，T-ICs／CSCs)。肿瘤前体细胞是存在于肿瘤组织中的少部分具有干细胞性质的细胞群，具有自我更新能力和不确定分化程度的潜能，是形成不同分化程度的肿瘤和肿瘤不断生长扩散的根源。肿瘤前体细胞学说的提出是人类认识肿瘤本质的一大进步，为肿瘤的发病机制、早期诊断以及恶性肿瘤根治方法的研究提示了新的方向。目前在人急性粒细胞白血病细胞、乳腺癌细胞和脑肿瘤细胞中发现并已分离出肿瘤前体／干细胞。然而，对于肿瘤前体细胞的调控机制存在着不同的理论，被广泛接受的是异常信号传导通路、非整倍核型发生、原癌基因激活与抑癌基因失活和端粒酶耗损理论等。所以，进一步研究肿瘤前体

3、细胞的调控机制将有助于揭示肿瘤形成的分子机制，有助于寻找针对肿瘤前体细胞进行肿瘤治疗的多个靶位，为根治恶性肿瘤提供新的治疗思路。2000年Fujita等通过差减杂交法从人的肝癌组织cDNA文库中发现，p28洲脒是一个在人肝细胞癌组织中相对特异性高表达的癌基因；目前新发现该基因还高表达于人食管鳞状细胞癌、结肠癌、胰腺癌以及肺癌。近年来发现p28酬帐基因编码的蛋白是人26S蛋白酶体(26Sproteasome)调节亚单位19S／PA700复合物的一种非ATP酶亚基，它与CDK4结合并参与CDK4／CyclinDl／p16INK4Q／Rbl／E2F．1信号

4、转导通路的调节，驱动肿瘤抑制蛋白Rbl的核内磷酸化失活和E2F．1的释放，促使细胞由Gl期向S期转化，进而紊乱了细胞周期；而且外源性转入癌基因p28翻M使其高表达的NIH／3T3细胞株可以使裸鼠荷瘤。最近，Nagao等人通过酵母双杂交发现黑色素瘤抗原MAGE．A4能与第二军医大学博士学位论文癌蛋白p28GANK特异性结合并抑制p28GANK成瘤活性。此外，癌蛋白p28GANK能与泛素蛋白连接酶MDM2相互作用，调节P53的泛素化及降解，进而抑制P53介导的细胞凋亡。临床统计提示，癌蛋白p28GANK的表达水平与肝癌及食管癌患者的预后相关，但是目前该基

5、因如何促进肝癌及食管癌发生发展的作用机制仍未明了。我室于2001年在国内首次克隆了癌基因p．2∥胱，并通过大量的临床肝癌样本的免疫组化检测，确认其表达蛋白p28GANK可能为目前己知的具有一定肝癌细胞特异性的癌蛋白。我组前期研究发现干扰肝癌细胞中p28GANK的表达可明显抑制细胞的增殖并可在体内外诱发肿瘤细胞凋亡，p28GANK直接结合NF．KB／ReiA，加速NF．KB出核，抑制其转录活性。此外，大鼠2-AAF／PH模型诱导的肝卵圆细胞活化过程中伴随着p2∥胱的mRNA和蛋白表达水平均上升、Rb磷酸化降解以及CDK4／CyclinDI的活化，提示p

6、28GANK可能在肝卵圆细胞介导的肝再生及肝卵圆细胞的细胞周期中发挥着重要作用；我室新发现OV6可以做为肝癌前体细胞的标志物，并研究了Wnffp．catenin信号通路在OV6阳性细胞亚群中的重要调节作用。我们观察到OV6阳性的肿瘤性肝前体细胞中朋俨的mRNA表达升高，而Rb和p53蛋白表达下降，这些都提示p28GANK可能与正常和肿瘤性肝前体细胞的活化存在某种联系。肿瘤相关蛋白调控肿瘤前体细胞的增殖和分化可能是肿瘤干细胞调控的机制之一，但是目前尚未见到癌蛋白p28GANK调控肝癌前体细胞的相关报道，因此，探讨癌蛋白p28GANK调控肝癌前体细胞活化

7、的分子机制是本课题研究的重点，旨在加深我们对肿瘤生物学的认识，为研发新的肿瘤治疗药物和方法提供理论依据。实验方法：1．载体及病毒构建：构建过表达p28GANK慢／腺病毒载体、由RNAi介导的低表达p28GANK的慢／腺病毒载体及对照慢／腺病毒载体，在293T／293A细胞系中进行病毒包装、扩增以及滴度测定。2．建立稳定细胞系：构建过表达及RNAi引起低表达p28GANK的SMMC．7721、HCC．LM3、Huh7、HepG2等稳定肝癌细胞系。3．免疫磁珠分选：以OV6、CDl33等作为肝癌前体细胞标志物，磁珠分选出肝癌前体细胞，比较p28GANK在

8、肝癌前体细胞以及非肝癌前体细胞中的表达差一2一癌蛋白p28GANK对肝癌前体细胞的调控作用及机制研究异，比较