gαq蛋白对cd4~+t淋巴细胞稳态增殖作用的调控及机制研究

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1、－．＂中困分类号：Ｒ的；Ｒ３６；Ｒ３９馨六’梦為聲燒硕±学位论文（专业学位）ＡＧａｑ蛋白对ＣＤ４可巧巴细胞稳态増殖作用的调控及机制研究院（系）、所临巧反学院研究生姓名蒋义捷学科、专业内科学导师姓名何成松教巧指导老师张玉窩傅壬—■－．１，本课题由国家自然科学基金项目资助项目批准号：別１０２２１０Ｖ－’ｎ．＇＇■－‘＇．．：－二〇—五年四月？．、Ｓ．１一一＇１ｒ—气沪州医学院硕±学

2、位论义目录Ｇａｑ蛋白对ＣＤ４叮淋己细胞稳态增殖作用的调控及机制研１０％１１．１中文摘要１１．２英文摘要４１．３前言８１．４材料与方法１３１．５结果２７１．６讨论３７１．７结论４２１．８参考文献４３１．９英汉缩略词对照表５３Ｇａｑ蛋白和Ｔ淋巴细胞稳态增殖在自身免疫中的作用研究２０（综述）５４扣抑医学院硕±学化论义Ｇａｑ蛋白对ＣＤ４叮淋己细胞稳态增殖作用的调控及机制究．摘要

3、＋ＧａＣＤ４目的；１．明确ｑ蛋白对Ｔ细胞稳态增殖的调控。２．阐明Ｇ＋ａＣＤ４Ｔ．。ｑ蛋白调控细胞稳态增殖的机制。方法：１建立骨髓嵌合鼠同龄同性别Ｇａ基因敲除小鼠和ｗｉｌｄＣ５７化／６小鼠进，ｑ行脱颈处死取其双下肢完整的股骨和腔骨，置于７０％酒精中浸泡３分钟，用无菌的郎Ｓ洗３次，转移至无菌的培养皿中，用１ｍｌ注射器将骨髓吹出。然后应用红细胞裂解液去除红细胞，进行骨髓单个核细胞计数。分别６取出４ｘｌ〇个细胞静脉注射到１０００ｃＧｙ致死剂量福照的同齡同性别ｗｉｌｄＣ日

4、７化／６小鼠中进行骨髓移植，建立骨髓嵌合鼠，继续在ＳＰＦ环境下饲养２个月，取脾脏进行实验。２．分离、纯化ｃＤｒｒ细胞。同龄同性别Ｇａｑ基因敲除小鼠和ｗｉｌｄＣ５７化／６小鼠或同批次的骨髓嵌合鼠的脾脏，经研磨、过滤制成单细胞悬液，应用红细胞裂解液去除红细胞。采用磁珠阳选的方法分离ＣＤ４Ｔ细胞。首先将脾脏单个核细ａｎ－ｔｉＣＤ４３０胞与生物素标记的在冰上膊育分钟，离也去除未结合的－抗体后，加入亲和素包被的磁珠，冰上滕育３０分钟后ＭＡＣＳ，应用Ｍｉｎｉ＋分选系统分别纯化ＣＤ４

5、Ｔ细胞。纯化的细胞在进行研究前，应用流式９５％细胞术进行纯度鉴定，未达到时可用新的分选柱进行再次纯化。＋３．检测ＣＤ４Ｔ细胞稳态增殖及其影响因素。应用上述分选方法分选＋Ｇａｑ基因敲除小鼠和ｗｉｌｄＣ５７ＢＬ／６小鼠的ＣＤ４Ｔ细胞。在体外进行６ＣＦ沈标记４ｘｌ〇后，每只小鼠分别给予静脉注射个细胞的剂量，静１巧州医学院硕壬学位论文脉注射给同龄同性别３００ｃＧｙ亚致死剂量福照的ｗｉｌｄＣ５７ＢＬ／６小鼠，在不同时间点，取其脾脏进行检测，应用流式细胞术根据ＣＦＳＥ巧

6、光－强度检测细胞的稳态增殖。实验设计如下：取８１２周龄同性别Ｃ５７ＢＬ／６小鼠２０只，分成２组，每组１０只，均给予３００ｃＧｙ亚致死６一剂量福照。第组每只静脉注射４ｘｌ０ＣＦ沈标记的Ｇａｑ基因敲除小＋６鼠脾脏ＣＤ４Ｔ细胞；第二组每只静脉注射４ｘｌ０Ｃ巧Ｅ标记的ｗｉｌｄ小＋鼠脾脏ＣＤ４Ｔ细胞；注射后的第２、５天每组取日只小鼠取其脾脏细胞，应用流式细胞术分析ＣＦＳＥ阳性细胞的增殖，并分别进行比较稳＋态增殖的差异。纯化的ＣＤ４细胞Ｔ细胞在进行稳态增殖前及稳态增殖的第２

7、、５天用流式细胞术进行ＢＴＬＡ、ＣＤ６化表面标记的检测，并比较表达的差异。结果：１．稳态增殖前，通过流式细胞仪检测比较，野＋生型与Ｇａｑ缺失型小鼠注射前ＣＤ４Ｔ细胞表面ＢＴＬＡ、ＣＤ６化的表达无明显差异（Ｐ＞〇．０５）。２．ＣＦ沈染色后，通过流式细胞仪的检测比＋较，２天组中野生型组与Ｇａｑ缺失组型小鼠ＣＤ４Ｔ细胞增殖无统计学＋意义（Ｐ＞０．０５）。５天组Ｇａｑ缺失组型小鼠ＣＤ４Ｔ细胞比野生组型＋＜小鼠ＣＤ４Ｔ细胞增殖更多（Ｐ０．０１）。３．通过流式细胞仪的检测比

8、＋较，２天组中Ｇａｑ基因敲除组小鼠和野生型小鼠中ＣＦＳＥ标记的ＣＤ４Ｔ细胞表面ＢＴＬＡ的表达无明显差异（Ｐ＞０．０５）、２天组巧生型小鼠ＣＤ６２Ｌ表达明显高于Ｇａｑ基因敲除组小鼠（ＰＣＯ．Ｏｌ）。５天组Ｇａｑ基因敲除组小鼠中ＣＦ沈标记的ＣＤ４可细胞表面ＢＴＬＡ、ＣＤ６２Ｌ的表泣明显低于５天组野生型小鼠组巧＜０．０１）。结论；１．Ｇａｑ蛋白促使ＣＤ少Ｔ细胞进行更多更快的稳态增殖。２．Ｇａｑ蛋白可通过ＢＴＬＡ、ＣＤ６化的２诉州民挙院