中枢胰岛素抵抗对神经元—星形胶质细胞间代谢偶联及神经元功能的影响

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1、Ｉ中枢胰岛素抵抗对神经元-星形胶质细胞间代谢偶联及神经元功能的影响Theeffectsofcentralinsulinresistanceonneuron-astrocytemetaboliccouplingandneuronalfunctions作者姓名：赵雪专业名称：内科学研究方向：内分泌代谢病基础研究指导教授：王桂侠教授学位类别：医学博士培养单位：白求恩第一医院论文答辩日期：2018年6月1日授予学位日期：年月日答辩委员会组成：姓名职称工作单位主席：高普均教授吉林大学第一医院委员：单忠艳教授中国医科大学附属第一医院管庆波教授山东省立医院刘全教授吉林大学第一医院姜晶教授吉林大学第一医

2、院陈政教授东北师范大学生命科学学院高素君教授吉林大学第一医院中文摘要中枢胰岛素抵抗对神经元-星形胶质细胞间代谢偶联及神经元功能的影响研究目的：近年来糖尿病发病率逐年增加，已成为严重威胁公众健康的疾病之一。糖尿病引起的中枢损伤即糖尿病相关性认知障碍也逐渐受到关注。胰岛素抵抗作为糖尿病的重要发病机制之一，参与了糖尿病相关并发症的发生发展。研究表明糖尿病相关性认知障碍的发生发展与中枢胰岛素抵抗关系密切。然而，现阶段中枢胰岛素抵抗对神经元形态与功能影响的相关研究较少，中枢胰岛素抵抗引起糖尿病相关性认知障碍的具体机制也尚不明确。生理情况下，神经元-星形胶质细胞间的代谢偶联对学习、认知及记忆形成等过程至

3、关重要，但中枢胰岛素抵抗情况下神经元-星形胶质细胞间代谢偶联的变化尚不清楚。基于此，本研究拟建立神经元-星形胶质细胞共培养体系下的胰岛素抵抗模型，观察中枢胰岛素抵抗对神经元形态与功能的影响，并探讨神经元-星形胶质细胞间代谢偶联在中枢胰岛素抵抗引起神经元损伤中的作用；之后，我们选用可以改善胰岛素抵抗的降糖药物进行干预，观察降糖药物对上述神经元损伤及神经元-星形胶质细胞间代谢偶联的改善作用。研究方法：⑴采用改良的“三明治式”共培养方法建立神经元-星形胶质细胞共培养体系，以模拟机体中枢部位神经细胞微环境，比较共培养体系与非共培养体系下神经元形态及细胞活性差异；并利用胰岛素、葡萄糖、棕榈酸三种方法进

4、行胰岛素抵抗模型的探索，通过MTT方法等观察三种造模方法对神经元的影响，寻找共培养体系下胰岛素抵抗的最佳方法；通过westernblot检测胰岛素信号通路相关蛋白水平进行中枢胰岛素抵抗的验证与评价；⑵通过HE染色，尼氏染色等方法观察胰岛素抵抗对共培养体系下神经元形态学的影响；通过荧光及流式细胞术检测和评估神经元的凋亡情况；通过westernblot方法检测神经元突触可塑性蛋白表达情况以评价突触功能；通过β半乳糖苷酶染色、端I粒酶活性检测及衰老相关蛋白Sirt1蛋白表达情况评估神经元的衰老情况；⑶通过westernblot方法检测神经元-星形胶质细胞间代谢偶联相关单羧酸转运体蛋白表达情况（MC

5、T1，MCT2，MCT4）；通过试剂盒检测培养基中、神经元细胞内及星型胶质细胞内相关能量代谢底物如乳酸、丙酮酸等变化；检测糖酵解相关关键酶的活性及蛋白表达情况；检测谷氨酸-谷氨酰胺循环中相关转运体的蛋白表达变化及谷氨酸浓度变化；⑷通过选取可以改善胰岛素抵抗的降糖药物进行干预，通过HE染色、尼氏染色观察神经元的形态变化；通过流式细胞术等方法检测降糖药物对神经元凋亡的改善作用；通过β半乳糖苷酶染色法以及衰老相关蛋白Sirt1蛋白表达情况评估降糖药物对神经元衰老的影响；通过westernblot检测神经元-星形胶质细胞间代谢偶联相关转运体的蛋白表达变化；通过试剂盒检测神经元-星形胶质细胞间代谢偶联

6、相关能量底物的变化；检测谷氨酸-谷氨酰胺循环中相关转运体及谷氨酸等浓度变化。研究结果：⑴利用改良的“三明治式”共培养方法建立神经元-星形胶质细胞共培养体系能够在最大程度上模拟机体中枢部位微环境，更有利于神经元生长，神经元形态更为健康，且共培养体系下神经元细胞活性更高；与葡萄糖、胰岛素相比，棕榈酸对神经元的杀伤作用更为明显；且0.1mM棕榈酸可以引起神经元发生胰岛素抵抗，表现为胰岛素信号通路相关蛋白表达下降，即PI3K表达下降，pIRS/IRS比值及pAkt/Akt比值下降；⑵中枢胰岛素抵抗可以使神经元形态发生明显改变，细胞突起数量减少、细胞间联系减少；突触可塑性相关蛋白表达下降，包括PSD9

7、5，Arc，synapsin1，pCREB/CREB，BDNF等蛋白表达下降；加速神经元凋亡情况；神经元衰老加速，包括β半乳糖苷酶染色阳性细胞增加，端粒酶活性下降，以及衰老相关蛋白Sirt1表达降低；⑶中枢胰岛素抵抗可以使神经元-星形胶质细胞间代谢偶联相关转运体表达下降，培养基中乳酸浓度下降；而神经元与星型胶质细胞内乳酸、丙酮酸浓度升高；与此同时神经元与星形胶质细胞内糖酵解相关酶即己糖激酶、丙酮酸激酶和乳酸脱