水泡性口炎病毒M蛋白抑制宿主抗病毒反应机制的研究

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1、中文摘要水泡性口炎病毒M蛋白抑制宿主抗病毒反应机制的研究水泡性口炎（Vesicularstomatitis）是一种由水泡性口炎病毒（Vesicularstomatitisvirus，VSV）感染引起的牛、马、猪等多种动物和人以口炎为主要特征的人兽共患性传染病。临床特征表现为唇、舌、牙龈、乳头、蹄匣等部位出现水泡或溃疡。由于VSV在许多国家的流行蔓延造成世界肉类市场的混乱，同时使感染动物（如猪和牛）的生产能力下降而造成严重的经济损失。因此，该病对养殖业的潜在危害不容忽视，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须通报的动物疫病。病毒感染是对人类威胁最大的病

2、原微生物感染性疾病之一,天然免疫系统作为防御病原微生物感染的第一道防线,在抵御病毒感染的过程中发挥着极为重要的作用。而许多病毒在进化过程中产生抑制或逃逸宿主抗病毒反应的能力，大量的研究证实，水泡性口炎病毒基质（M）蛋白可以通过抑制宿主细胞转录、细胞mRNA由胞核向胞浆的转运、宿主蛋白的翻译等方式抑制宿主抗病毒蛋白的表达，从而阻断宿主的抗病毒反应以利于自身复制。其中有关M蛋白抑制细胞mRNA由胞核向胞浆的转运以及宿主细胞蛋白翻译的机制已有大量的研究报道，而M蛋白抑制宿主细胞转录的机制鲜有研究。病毒作为宿主细胞的外来异物，主要通过其自身编码的蛋白和宿主

3、细胞的蛋白相互作用来调控宿主细胞基因的差异表达及信号通路的改变。因此，本研究从病毒与宿主互作的角度入手,探讨M蛋白抑制宿主细胞转录的分子机制。首先，构建了M蛋白真核表达载体，将其转染BSR-T7/5细胞后，通过检测发现在转染后4小时，M蛋白抑制了宿主细胞的转录。为了进一步阐述M蛋白抑制宿主细胞转录的机制。以M蛋白作为诱饵蛋白，利用酵母双杂交试验筛选与M蛋白相互作用的宿主蛋白。对筛选获得的宿主蛋白进行分析发现，GTF2H5（真核细胞通用转录起始因子TFIIH亚基p8）是一个转录相关蛋白，因此将其作为候选蛋白开展了后续相关研究。由于酵母双杂交实验会得到

4、大量假阳性结果，因此，本研究利用酵母回转、GST-pulldown、I激光共聚焦实验对M蛋白与GTF2H5（p8）蛋白的相互作用加以验证。随后，我们将M蛋白N端Flexible结构域和C端Globular结构域分别构建到酵母质粒中，通过酵母回转和β-半乳糖苷酶活性实验分析发现，M蛋白C端Globular结构域是其与GTF2H5（p8）蛋白互作的关键结构域。对该结构域上所有暴露于表面的氨基酸进行突变后，利用酵母回转和β-半乳糖苷酶活性实验筛选到M蛋白I96、E156、R159、R160氨基酸是M与p8相互作用的关键氨基酸位点。将这四个氨基酸位点分别突

5、变为丙氨酸后，M蛋白则丧失了抑制宿主细胞转录的能力。同时，过表达p8蛋白能显著减弱M蛋白和VSV对宿主细胞转录的抑制作用，但过表达p8蛋白不影响病毒的转录和复制。上述实验结果表明，M蛋白通过与p8蛋白相互作用，从而抑制宿主细胞转录。M蛋白不仅能够抑制宿主细胞转录，而且还参与对宿主细胞翻译的抑制。从酵母双杂交实验筛选获得的蛋白中，我们发现一个与宿主细胞翻译相关的蛋白eIF3i（真核细胞翻译起始因子3亚单位i）。M蛋白是否通过与eIF3i相互作用，抑制宿主蛋白翻译来影响病毒的复制呢？我们首先利用酵母回转、GST-pulldown、激光共聚焦实验验证了二

6、者的相互作用。随后，将M蛋白N端Flexible结构域和C端Globular结构域分别构建到酵母质粒中，酵母回转实验分析发现，M蛋白C端Globular结构域是其与eIF3i蛋白相互作用的关键结构域。对此结构域所有暴露于表面的氨基酸进行突变后，利用酵母回转和激光共聚焦实验分析发现，对122-181之间的部分氨基酸进行突变后能减弱M与eIF3i的相互作用。以上结果显示，M蛋白与eIF3i相互作用的区域位于122-181氨基酸之间。为了确定eIF3i在VSV复制过程中的作用，我们分别检测了干扰或过表达eIF3i对VSV复制增殖的影响。当干扰eIF3i表

7、达时，VSV的转录、复制、子代病毒的产生和病毒蛋白的表达水平明显升高，而过表达eIF3i对病毒复制影响并不显著。为了进一步明确M蛋白是否通过与eIF3i相互作用抑制宿主蛋白翻译来影响病毒复制，本研究利用荧光素酶报告实验检测了M蛋白对宿主细胞翻译水平的影响。结果显示，单独表达M蛋白不影响宿主细胞的蛋白翻译水平，进而排除了上述假设。近年来的研究发现，eIF3i不仅参与了宿主细胞蛋白的合成，还可以与Akt1相互作用促进Akt1的磷酸化。通过对病毒感染过程中Akt1的磷酸化水平进行检测发现，VSV能够显著抑制Akt1的磷酸化。进一步对Akt1介导的干扰素刺

8、激II基因（ISGS）表达情况的检测发现，干扰eIF3i后ISGS转录水平显著下调。同时，干扰eIF3i后Akt1的磷酸化