三种无“盖子”结构脂肪酶的制备及其酶学性质研究

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1、硕士学位论文三种无“盖子”结构脂肪酶的制备及其酶学性质研究作者姓名李菲学科专业食品科学与工程指导教师蓝东明副研究员所在学院食品科学与工程学院论文提交日期2018年4月Astudyonpreparationandenzymaticcharacteristicsofthreeno-liddomainlipasesADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：LiFeiSupervisor：Dr.LanDongMingSouthChinaUniversityofTechnologyGuangzhou,China

2、分类号：Q814学校代号：10561学号：201520120548华南理工大学硕士学位论文三种无“盖子”结构脂肪酶的制备及其酶学性质研究作者姓名：李菲指导教师姓名、职称：蓝东明副研究员申请学位级别：工学硕士学科专业名称：食品科学与工程研究方向：酶工程与生物催化论文提交日期：2018年4月20日论文答辩日期：2018年5月31日学位授予单位：华南理工大学学位授予日期：年月日答辩委员会成员：主席：辛国荣委员：王加生段学武王永华杨博摘要微生物脂肪酶是一种高效的生物催化剂，可实现绿色催化，被广泛应用于食品加工、医药化工及能源等众多领域。新的酶源及性能优良的脂肪酶基因有待

3、深入地挖掘，以满足工业生物技术应用的需求。自然界存在一类无“盖子”结构的脂肪酶，相对于普通的脂肪酶，其催化活性中心上方缺少明显的“盖子”结构。其特殊的酶蛋白结构是否赋予了该类酶独特的酶学功能特性仍有待深入研究。为此本研究选取三种不同微生物来源的无“盖子”结构脂肪酶为研究对象，利用异源表达系统制备了酶蛋白，系统地研究了其酶学性质，并采用酶催化通道分析及分子动力学模拟技术研究其结构与底物选择性及结构稳定性的结构基础，旨在深入理解无“盖子”结构脂肪酶的结构功能关系，同时为其工业应用提供科学理论指导。主要的研究内容和结果归纳如下：（1）无“盖子”结构脂肪酶的基因克隆、表

4、达与纯化通过结构分析及基因合成技术获得BsLip、PmLip及SeLip三种无“盖子”结构脂肪酶基因，并克隆于大肠杆菌表达载体pET22b中，获得重组质粒pET22b-BsLip、pET22b-PmLip以及pET22b-SeLip。酶蛋白分别在大肠杆菌表达菌株BL21condonplus（DE3），Rossetagami（DE3）和BL21condonplus（DE3）获得成功表达，进一步采用镍柱亲和层析及阴离子交换层析分离纯化了重组酶。以三丁酸甘油酯为底物，测定纯化的BsLip、PmLip及SeLip三种脂肪酶水解活力分别为108U/mg、343U/mg及2

5、1U/mg。（2）无“盖子”结构脂肪酶酶学性质研究BsLip、SeLip以及PmLip三种脂肪酶的最适反应pH皆为7。BsLip和SeLip最适反应温度为35℃，而PmLip最适反应温度为45℃。PmLip在45℃孵育下的半衰期为1.5h，而BsLip和SeLip在45℃处理0.5h后酶活力下降到30%以下。三种脂肪酶都对中短链的甘油三脂比较偏好，对长链甘油三酯橄榄油水解活力都较低。Cu2+和Zn2+等重金属离子对三种脂肪酶的酶活力影响较大，可抑制酶活力，酶活力损失严重，而Mg2+、Mn2+和Ca2+对三种脂肪酶活力影响较小。BsLip和SeLip耐受极性有机溶

6、剂能力弱，而PmLip表现出良好的有机溶剂耐受性，极性和非极性有机溶剂及表面活性剂对其酶活力没有明显的抑制作用。（3）无“盖子”结构脂肪酶催化通道（Tunnel）结构分析及耐受极性有机溶剂的分子机制初步研究利用Mole2.ui软件对无“盖子”结构脂肪酶、酯酶和角质酶三类丝氨酸水解酶的催化I通道Tunnel的构型进行了分析和比较。结果显示，无“盖子”结构脂肪酶的Tunnel为浅显构型，所以可能导致无“盖子”结构脂肪酶偏好水解中短链甘油三酯底物；酯酶的Tunnel为狭长构型，只能容许分子量小的脂肪酸酯进入其活性中心；角质酶的Tunnel为宽浅构型，可以容纳更大的分子

7、，这可能是角质酶除了可以水解甘油三酯底物外，同时对角质、蜡质等聚酯等大分子底物亦具有明显水解活力的原因。采用分子动力学模拟方法研究了PmLip和SeLip在甲醇/水（1:1，v/v）和乙醇/水（1:1，v/v）溶液中总体构象的变化情况。RMSD结果显示，PmLip在极性有机溶剂甲醇/水（1:1，v/v）和乙醇/水（1:1，v/v）都很稳定，而SeLip在极性有机溶剂甲醇/水（1:1，v/v）和乙醇/水（1:1，v/v）的稳定性较差。通过对比分析PmLip和SeLip的三维结构，发现PmLip在R35和E83位形成了盐桥以及C34和C96之间形成二硫键，而SeLi

8、p相应的位置却没有盐桥和