产碱性脂肪酶菌株aspergillus+awamori+hb03的筛选与鉴定与脂肪酶酶学性质的研究

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1、分类号VDC密级硕士学位论文产碱性脂肪酶菌株AspergillusawamoriHB一03的筛选与鉴定及脂肪酶酶学性质的研究Isolationandidemificationofanalkalinelipase--producingstrainAspergillusawamoriHB一03anditslipasecharacterization作者姓名：学科专业：学院(系、所)：指导教师：黄斌微生物学资源加工与生物工程学院夏金兰教授论文答辩日期量必答辩委员会主席中南大学2010年5月㈣9川8舢0洲6m眦i●IⅢ9iii●1咖Y原创性声

2、明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：兰童盐：关于学位论文使用授权说明本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文；学校可根据国家或湖南省有

3、关部门规定送交学位论文。查[!年盟亟±生些论塞擅要摘要脂肪酶是一类能催化水解长链三酰甘油脂的酶，是目前最重要的工业酶之一。随着酶生物技术的迅速发展，微生物脂肪酶已成为全世界热门研究的课题。目前，微生物脂肪酶的应用范围已经由最初的食品加工、洗涤、制革行业扩展到化妆品、生物柴油、医药、环境等众多工业和科研领域上。本文从富含油脂的样品中筛选到一株产脂肪酶的真菌HB。03，并对其进行了形态学和分子生物学鉴定；对该菌株的产酶条件进行了优化；对脂肪酶进行了分离纯化，同时对其酶学性质做了初步的研究。(1)来源于长沙各地富含油脂的样品经富集培养后，采

4、用平板水解圈法进行初筛，得到18株可在以橄榄油为唯一碳源的油脂同化培养基上生长且形成明显水解圈的菌株，对这些株菌进行复筛，获得一株产酶活力相对较高的菌株HB．03。(2)利用形态学和分子生物学手段对该菌株进行了鉴定，通过对其菌落特征、个体形态的观察和18SrDNA序列分析，最终确定该菌株为泡盛曲霉(Aspergillusawamori)。(3)通过对HB．03菌株的培养条件及初始产酶培养进行优化，发现了HB．03菌株的在以1％的橄榄油为诱导物，O．5％的蔗糖为碳源，2％的蛋白胨和O．5％的酵母粉为复合有机氮源，0．1％(NH4)2S0

5、4为无机氮源，pH为7．0的培养基中，于30℃，180rpm的摇床培养36h，可达最大酶产量一45．94-2．3)U／mL。(4)AspergillusawamoriHB．03胞外脂肪酶经90％硫酸铵沉淀、SephadexG．75凝胶过滤纯化，纯化倍数和回收率分别为10．6和18．84％，经p-NPP比色法测得该酶的比活为1862．2U／mg。SDS．PAGE显示该脂肪酶分子量约为68kDa。(5)对纯化的脂肪酶进行酶学性质研究发现，纯化酶的最适作用pH和最适作用温度分别为8．5和40℃，该酶具有一定的热稳定性，在pH7．0．9．0范

6、围内稳定性也较好；Cu2+，Fe3+和M92+在浓度为lmmol／L时就可以抑制酶的活性，其中Cu2+对脂肪酶活性的抑制作用最大；CTAB和SDS强烈抑制纯化酶的活性，而EDTA对其影响非常微弱；纯化脂肪酶对底物p-NPP酶动力学常数Km值和Vmax分别是O．13mmol／L和60．6mmol／L／min。综上所述，分离自长沙各地富含油脂的样品的AspergillusawamoriHB．03是一株碱性脂肪酶的高产菌株；对分离纯化自该菌株的碱性脂肪酶的酶学性质研究表明，该酶具有很好的应用前景。关键词：泡盛曲霉，碱性脂肪酶，分离纯化，酶学

7、性质ⅡABSTRACTLipasescancatalysethehydrolysisoflongchaintriglycerides，whichareoneofthemostimportantindustrialenzymes．Microbiallipasesarecurrentlyreceivingmuchattentionwiththerapiddevelopmentofenzymetechnology．Lipasesconstitutethemostimportantgroupofbiocatalystsforbiotechno

8、logicalapplications．Recently，themicrobiallipasesarewidelyappliedinthedetergent，food，flavourindustry,biocatalyt