米曲霉脂肪酶AOL的酶学性质、晶体学及定点突变研究

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1、硕士学位论文米曲霉脂肪酶AOL的酶学性质、晶体学及定点突变研究作者姓名赵格学科专业食品科学与工程指导教师王永华教授所在学院食品科学与工程学院论文提交日期2018年6月StudyonBiochemicalProperties,CrystalStructureandSite-directedMutagenesisofaLipasefromAspergillusOryzaeADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：GeZhaoSupervisor：Pro.WangYonghuaSouthChinaUni

2、versityofTechnologyGuangzhou,China分类号:学校代号:10561学号:201520120821华南理工大学硕士学位论文米曲霉脂肪酶AOL的酶学性质、晶体学及定点突变研究作者姓名：赵格指导教师姓名、职称：王永华教授申请学位级别：工学硕士工程领域名称：食品科学与工程论文形式：基础研究研究方向：酶工程论文提交日期：2018年4月20日论文答辩日期：2018年5月31日学位授予单位：华南理工大学学位授予日期：年月日答辩委员会成员：主席：辛国荣委员：段学武王加生王永华杨博摘要甘油单酯和二酯脂肪酶是一类具有特殊底物选择性的脂肪酶，它们几乎

3、只作用于甘油单酯和甘油二酯底物，而不作用于甘油三酯底物。其特殊的底物选择特性使其在工业应用中极具潜力。酶蛋白三维结构的解析，有利于深刻理解该类酶的结构功能关系，并为酶的理性改造提供结构基础。遗憾的是，目前单酯与二酯脂肪酶晶体结构信息仍然缺乏。本课题以来源于米曲霉的甘油单酯和二酯脂肪酶Aspergillusoryzaelipase(AOL)为研究对象，采用毕赤酵母异源表达了该脂肪酶并表征了其酶学性质，解析了其晶体结构，利用定点突变和生物信息学分析等方法初步研究了AOL结构和功能关系。主要研究内容以及结果如下：（1）AOL在毕赤酵母中异源表达、纯化及酶学性质研究

4、。发酵了AOL组成型表达的毕赤酵母工程菌株，利用阴离子交换层析对重组AOL进行分离纯化，SDS-PAGE分析发现目标蛋白条带不均一。去糖基化酶处理实验证实，AOL在毕赤酵母中异源表达发生了糖基化。酶学性质表征结果显示：重组AOL的最适温度为50℃，最适pH为6.0。在中温（30~50℃）、偏酸性及中性条件下比较稳定，最适醇和脂肪酸底物分别为甘油和癸酸。（2）AOL的基因克隆以及在大肠杆菌中异源表达、纯化。为获得无糖基化修饰的AOL蛋白，将AOL基因克隆至pFL-B13cl表达载体上，并转化至大肠杆菌SHuffleT7中进行异源表达。在15℃、0.4mMIPT

5、G条件下诱导培养18小时后，大部分SUMO-AOL重组蛋白为可溶表达。利用SUMO蛋白酶酶切结合镍柱纯化可获得纯度较高的无SUMO蛋白标签的重组AOL蛋白。（3）AOL的晶体结构解析。采用凝胶过滤层析进一步纯化获得高纯度的AOL蛋白。在蛋白浓度10mg/mL、20℃、0.1MBis-TrispH6.4、41%w/vpolypropyleneglycolP400条件下获得了具有较高衍射质量的晶体。AOL的晶体结构(PDBID:5XK2)通过分子置换的方法得以解析，其分辨率为1.7Å。AOL呈现典型的α/β水解酶折叠结构，由8个β折叠片和11个α螺旋组成。AOL

6、的催化三联体由Ser153、Asp206和His268组成，氧负离子洞由Ser91和Leu154的主链NH基组成。（4）AOL突变体的制备及酶学性质研究。根据AOL晶体结构的分析和参考已有的研究成果，选择V269关键位点进行定点突变。构建获得了V269I、V269L、V269E、IV269Q、V269D、V269R和V269A7个突变体，并通过毕赤酵母表达和离子交换层析纯化，获得了较高纯度的重组AOL突变体蛋白。甘油二酯底物水解结果显示，相比于野生型，亲水性氨基酸替代突变体V269D、V269E、V269R、V269Q水解活力分别有6.1、3.0、2.5、1

7、.2倍的增加。甘油和油酸底物酯化实验结果发现，亲水性氨基酸替代突变体V269D、V269E、V269R、V269Q的酯化活力分别有2.6、1.6、1.6、1.4倍的增加。小体积氨基酸替代突变体V269A的水解活力和酯化活力分别有2.3和1.2倍的提高。然而，强疏水性氨基酸替代突变体V269L和V269I的水解活力和酯化活力有轻微的下降。最后，采用了同源模拟和分子对接等生物信息学手段初步探讨了V269位点各个突变体活力变化的原因。关键词：甘油单酯和二酯脂肪酶；晶体结构；定点突变；酶活力IIAbstractMono-anddiacylglycerollipase

8、s(DAGLs)areasmallgroupofli