黑曲霉基因组中单宁酶基因的挖掘筛选及蛋白表达研究

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1、硕士学位论文黑曲霉基因组中单宁酶基因的挖掘筛选及蛋白表达研究作者姓名刘凤玲学科专业生物工程指导教师王斌副教授校外导师吴新良总经理所在学院生物科学与工程学院论文提交日期2018年
3月ScreeningoftannasegenesinAspergillusnigerandtannaseproteinexpressionADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：LiuFenglingSupervisor：AssociateProf.WangBinSouthChinaUniversityofTechnol

2、ogyGuangzhou,China分类号：Q81学校代号：10561学号：201521034127华南理工大学硕士学位论文黑曲霉基因组中单宁酶基因的挖掘筛选及蛋白表达研究作者姓名：刘凤玲指导教师姓名、职称：王斌副教授申请学位级别：硕士学科专业名称：生物工程研究方向：微生物酶学论文提交日期：2018年3月26日论文答辩日期：2018年3月19日学位授予单位：华南理工大学学位授予日期：年月日答辩委员会成员：主席：吴振强委员：凌飞罗晓春罗剑飞夏枫耿华南理工大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别

3、加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：斗pt－，全日期：fi)(B'年2月；｝日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华南理工大学。学校有权保存并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅（除在保密期内的保密论文外）；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、

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5、橡子酒和生产没食子酸。同时，单宁酶可用作果汁澄清剂和咖啡软饮料的调味剂，有助于减少单宁对茶饮料和食品中的不利影响；用于动物食品制剂中作为添加剂，提高动物的消化率；用于环境生物技术，例如处理富含多酚类物质的制革废水。产单宁酶微生物种类繁多，在大部分真菌、细菌和酵母中均存在，其中曲霉菌属产单宁酶量最高。本文以一株低蛋白背景的黑曲霉菌株为出发菌株，构建单宁酶黑曲霉表达系统，对黑曲霉基因组中单宁酶基因进行挖掘，筛选出单宁酶酶活最高的菌株，并对其酶学性质进行研究，主要研究了以下内容：（1）从AspGD数据库中找到黑曲霉中有17个与单宁酶有关的基因，将其氨基酸序列进行比对

6、进行系统进化树分析。利用同源重组原理成功构建出17个单宁酶的黑曲霉过量表达菌株。（2）利用适合测定胞外单宁酶酶活的可见分光光度法，对17株重组单宁酶菌株进行酶活的测定及蛋白含量的测定，最后筛选出单宁酶酶活最高的一株黑曲霉转化株Bdel4_Tan7，发酵液上清第168h酶活最高达到111.9U/mL，粗酶液中单宁酶纯度达到70%。上罐发酵液第138h时酶活力达到最高为1385.5U/mL，比摇瓶发酵液酶活提高了十倍以上，表明成功构建出一株可用于工业化大量生产单宁酶的重组单宁酶菌株。（3）通过脱盐和凝胶过滤层析将重组单宁酶Bdel4_Tan7进行纯化，纯化后单宁酶

7、纯度达到90%以上。重组单宁酶分子量大小约为85kDa，用糖苷酶PNGaseF去糖基化验证得到该重组单宁酶是一个糖蛋白。且重组单宁酶的最适pH为7.0，最适温度为40°C。++2+2+2+2+2+加入K、Na或Cd对单宁酶酶活的测定影响不大，加入Mg、Ca、Cu、Ni或2+2+Na2EDTA明显抑制单宁酶活力，而加入1mM的Mn或Co大约能提高30%的单宁酶活力。关键词：黑曲霉；重组表达；单宁酶；基因筛选IAbstractTanninacylhydrolase(tannase,EC3.1.1.20)catalyzesthehydrolysisofhydroly

8、zabletannins.Itiswi