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1、利用宏基因组技术筛选脂肪酶基因方法的研究与分析一.提取总DNA。这一步可得到叫组DNA，然后分别进行以后的实验。1.提取土壤总DNA.我们先采集土壤样品，将其分八1，八2，八3$1$2,83两组，A组直接提DNA,在B组土壤中加适量橄榄汕、植物汕及各种营养成分，搅拌后37°C培养一周后提DNA。以达到富集和扩大基因总fi的目的。这两组分别进行一下两步实验。运用改良的方法：取5g过筛研磨过的土样，加入15mL洗涤液洗涤土样，9000r/min离心10min,去上清，反复洗涤3次;加入11.5mL提収液和250UL溶菌酶，
2、37°C下225r/min水浴30min;加入50UL蛋白酶K,37°C下225r/min水浴30min;加入1•5mLSDS,65'C下225r/min水浴2h;4000r/min离心10min;取上清，加入等体积氯仿，异戊醇抽提(9000r/min离心10min)3次;取上清，加入1/I预冷无水乙醇，一20'C沉淀30min;9000r/min离心10min,加入1mL蒸馏水溶解沉淀，4"C保存.2.提収污水总DNA.同样，我们先采集污水及少量污泥样品，将其分为Cl,C2,C3,D1,D2，D3两组，C组直接提DN
3、A，在D组屮倒入橄榄油、植物油及各种营养成分并培养。这两组分别进行一下两步实验。本实验用低熔点琼脂糖包埋法提取水样的宏基因组大片段DNA,得到的片段长度在48Kb以上。由于单一包埋诀中基因组DNA含量较低，因此多个琼脂糖包埋块一起用酶法纯化后浓缩以达到提高基因组DNA的浓度。为了满足建库要求，以后用吹打法对其进行了小片段化。样品基因组DNA的提取在CTAB-NaCl基础上稍作修改。(1)取样品lml于1.5ml离心管，12，OOOrpm离心5min弃上清，重该操作3次；(2)加入567U1TE，用吸管反复吹打使菌体重悬
4、；(3)加30ull0%SDS和3ul20mg/ml蛋白酶K，用旋涡振荡仪混匀，37°C温浴60min;(4)加100u15mol/LNaCl充分混匀，再加入80u1的5%CTAB/NaCl溶液，混合并置65°C温浴30min；(5)加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀。4'C于12,OOOrpm离心5min，上淸液转移至另一离心管中；(6)重复(5)中氯仿/异戊醇抽提，直到看不见界面为止，以除去多糖和其他大分子；(7)上清液转移至另一新的离心管中，加入0.6倍体积的异戊醇，轻轻混匀直到DNA沉淀下来，-20°C放置30mi
5、n。取出后4°C下12，OOOrpm离心2min，弃上清；(8)用500ML乙醇清洗沉淀，4°C下12,OOOrpm离心2min，弃上清；(9)加入100ULTE溶解DNA。(10)NaAC无水乙醇沉淀DNA。二.DNA纯化采用胶回收的方法纯化通过间接提取法提取的DNA。DNA在1.5%琼脂糖凝胶以10V/cm电压电泳分离3小时，用胶回收纯化。三.DNA宏基因组文库的构建1.DNA酶切时间优化用BamHI酶切，每隔3()分钟从酶切体系中吸取2ul,与1ul10XLoadingbuffer混匀。在1%琼脂糖凝胶以9V/c
6、m的电压电泳分离40分钟，监测6小吋以内的酶切产物变化。确定酶切片段集中在6〜9Kb的最佳酶切时间。2DNA酶切产物纯化回收在1%琼脂糖凝胶以9V/cm的电压电泳分离1小吋，用OMEGA胶回收试剂盒回收2〜9Kb的DNA片•段。1.利用改进的碱裂解法提取质粒（购买含质粒的大肠杆菌）1.从LB平板上挑取单克隆菌体，接种于LB液体培养基（含100Ug/ml氨苄青霉素）中，37°C,200rpm，振荡培养过夜；2.10000rpm,离心1分钟，弃上清液；3.用lmlSTE重悬菌体，振荡混匀，10000rpm离心1分钟，弃上清
7、；4.加入100ul预冷的溶液I重悬菌体，冰浴2分钟；5.加入200Ml新配置的溶液II,盖紧管口，轻轻颠倒离心管2次，充分混匀，冰浴3分钟；6.加入150溶液III，盖紧管口，轻轻颠倒离心管5次，冰浴5分钟；7.10000rpm离心10分钟，弃沉淀，将上清液转移至新的EP管中；8.加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，浞匀，4°C,12000rpm离心10分钟，上清液移至新的离心管中；9.加入等体积的氯仿混匀，4°C,12000rpm离心10分钟，上清液移至新的EP管中；10.加入2倍体积的无水乙醇，混匀，静置2分钟，150
8、00rpm弃上清；11.将沉淀干燥除去残余乙醇，加入20ul的无菌TE,溶解沉淀；12.加入1Ml的RNA酶，37'C反应30分钟，将质粒DNA溶液保存-20°C4载体的酶切载体DNA的限制性酶切：6ulpBSK⑴质粒（约60yg）,2ul（20U）BamHI,2u110X缓冲液，10u1去离子水，混合，37°C保温1小时。1%琼
