宏基因组功能基因筛选.ppt

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1、宏基因组功能基因的筛选WCX2011年3月17日目录宏基因组简介宏基因组的常用研究方法16S(18S)rDNA测序宏基因组文库—功能基因筛选（策略一）宏基因组的测序—功能基因筛选（策略二）宏基因组（Metagenome）Metagenome作为一个新名词最初由美国科学家Handelsman及其研究组于1998年提出，定义为“theGenomesoftheTotalMicrobiotaFoundinNature”，即指任何特定环境样品中全部微生物遗传物质的总和,并且目前主要是指环境样品中细菌和真菌基因组的总和。MetagenomeV

2、SGenome目录宏基因组简介宏基因组的常用研究方法16S(18S)rDNA测序宏基因组文库—功能基因筛选（策略一）宏基因组的测序—功能基因筛选（策略二）MetagenomicsinvolvesconstructingDNAlibrariesfromenvironmentalDNAConstruct16S(18S)rRNAgenelibraryusingPCRsequenceEnvironmentalsampleCloneintovectoregplasmid,cosmidphosmid,BACIntroduceintohoste

3、gE.coliExtractmetagenomicDNAMetagenomiclibraryScreenforspecificsequencesbyPCRorhybridisationFunctionalscreeningforexpressionofparticularphenotypeSIGEX16SrDNA指的是细菌基因组中编码核糖体16SrRNA分子的对应的DNA序列，也就是16SrRNA的编码基因。其长度大约为1500bp通过16SrDNA的测序，可以分析环境的群落构成，以及进行细菌的分类和进化分析。细菌16SrRNA的

4、测序分析Ashelford等（2005）通过对4383个细菌16SrDNA的序列进行比对分析，表明16SrDNA全长序列中包含9个可变区（V1-V9）和10个保守区。其中保守区反映生物物种间的亲缘关系，可变区则表明物种间的差异。Chakravorty等（2007）总结16SrDNA的序列，及其中九个9个可变区和10个保守区的位置和长度，并指出不同的可变区适合不同菌群的鉴定分析。其中V3（约60bp）和V6区（约70bp）可以分别用来鉴定大多数细菌。细菌16SrRNA的V3或V6区的测序分析16SrDNA通过设计特异的PCR引物，扩

5、增得到V3或V6区的序列，然后两端加上接头，便可利用Illumilla的高通量测序技术对V3或V6区进行测序分析，以获得环境样品中细菌等物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。真菌ITS的高通量测序分析ITS(InternalTranscribedSpacers)，即核糖体内转录间隔区，是位于28SrDNA的3’端与18SrDNA的5’端之间的序列ITS常用于真菌的分类研究，其长度一般为650-750bpITS包含ITS1和ITS2两个区域。其中ITS1位于18SrDNA和5.8SrDNA之间，ITS2位于5.

6、8SrDNA和28SrDNA之间ITS1和ITS2是中度保守区域,其保守性基本上表现为种内相对一致,种间差异比较明显。ITS的序列分析能实质性地反映出属间、种间以及菌株间的碱基对差异,此外ITS序列片段较小、易于分析,目前已被广泛应用于这种特点使ITS适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。通过设计特异的PCR引物，扩增得到ITS序列，然后两端加上接头，便可利用Illumilla的高通量测序技术对ITS进行测序分析，以获得环境样品中真菌等的物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等

7、诸多信息。宏基因组文库MetagenomicLibrary通过PCR或者杂交筛选特定序列通过功能筛选特定表型的阳性克隆环境样品抽提DNA克隆(多种载体)转化适宜宿主细菌(如大肠杆菌)宏基因组文库的构建宏基因组文库的分析宏基因组文库SIGEX基于宏基因组分离筛选功能基因的四个技术要素载体Vector宿主Host自然产品筛选平台NaturalProductDiscoveryPlatform环境样品DNA制备DNAPreparation高通量筛选HighThroughputScreening环境样品DNA制备原位裂解法：将土壤样品直接悬

8、浮在裂解缓冲液中处理,继而抽提纯化。此法操作容易、成本低、DNA提取率高、偏差小,但由于强烈的机械剪切作用,所提取的DNA片段较小(1-50kb)，且腐殖酸类物质也难以完全去除。异位裂解法：采用物理方法将微生物细胞从土壤中分离出来,然后采用较温和的